[发明专利]一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。该方法包括：将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s。本发明脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。

背景技术

脉冲场凝胶电泳(PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis)是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子(>10kb)移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向(有一定夹角，而不是相反的两个方向)变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。现今，PFGE作为一种基因分型技术得到广泛的应用。目前，较多关于PFGE的应用集中在致病菌基因分型以及溯源方面，而从已有的报道看出这些致病菌大多为革兰氏阴性菌，鲜有关于PFGE在革兰氏阳性菌应用中的报道。

革兰氏阳性菌大部分为耐热芽孢杆菌，这些耐热芽孢杆菌在食品尤其是乳制品生产中会造成重大损失。主要在乳制品企业生产中表现在耐受传统的巴氏杀菌(72℃/15s)，有些甚至能耐受超高温杀菌(UHT，140-145℃/2-5s)而存活下来，对生产加工甚至最终产品有重要影响。例如，枯草芽孢杆菌对特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟。

目前，适合于革兰氏阴性菌的PFGE技术无法对革兰氏阳性菌进行准确的基因分型，PFGE在乳源革兰氏阳性菌研究尚未有研究。因此，开展乳源革兰氏阳性菌PFGE研究应用一方面能为这类菌进行基因分型；另一方面能进行溯源研究，控制耐热芽孢菌对生产加工和产品影响，减少企业损失。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。该脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，包括如下步骤：

将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s。

在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的初始转换时间为2.2s，终末转换时间为10s。

作为优选，脉冲场凝胶电泳的梯度电压为5～7V/cm，电泳液温度为12～16℃，电压角度为100°～120°，初始电流为140～170mA。

在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的梯度电压为6V/cm，电泳液温度为14℃，电压角度为120°，初始电流为170mA。

作为优选，脉冲场凝胶电泳的运行时间为15～16h。

在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳运行时间为15h。

作为优选，裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。

作为优选，以mL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5：(1～3)：(7～9)。

优选地，以mL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5：2：8。