[发明专利]一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法有效
| 申请号： | 201610125266.8 | 申请日： | 2016-03-04 |
| 公开（公告）号： | CN105671166B | 公开（公告）日： | 2019-01-29 |
| 发明（设计）人： | 王林林;王伟军;何光华;储小军;李海龙 | 申请（专利权）人： | 杭州贝因美母婴营养品有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/683 | 分类号： | C12Q1/683;C12Q1/04;C12R1/125;C12R1/085;C12R1/10;C12R1/07 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 赵青朵 |
| 地址： | 311106 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 乳源革兰氏 阳性 脉冲 凝胶电泳 方法 | ||
1.一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s；
所述脉冲场凝胶电泳的梯度电压为5～7V/cm，电泳液温度为12～16℃，电压角度为100°～120°，初始电流为140～170mA。
2.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述脉冲场凝胶电泳的运行时间为15～16h。
3.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
4.根据权利要求3所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，以mL/mg/mg计，裂解液中所述细胞裂解液、所述蛋白酶K与所述溶菌酶的用量为5：(1～3)：(7～9)；所述裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的体积比为(40～60)：4，所述乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～5。
5.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述裂解的温度为50～55℃，时间为2～5h，转速为50～70rpm。
6.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述DNA酶切采用的限制性内切酶为XbaI内切酶。
7.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述DNA酶切的温度为37℃，时间为2～4h。
8.根据权利要求1所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述将乳源革兰氏阳性菌裂解之前还包括初步裂解的步骤，所述初步裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的脉冲场凝胶电泳分型方法，其特征在于，所述乳源革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌中的一种或几种。
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