[发明专利]聚羟基脂肪酸酯PHA颗粒结合蛋白PhaP突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了聚羟基脂肪酸酯PHA颗粒结合蛋白PhaP突变体及其制备方法与应用。本发明提供的蛋白质，是如下A)或B)：A)对聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白PhaP氨基酸序列中至少一个氨基酸残基进行氨基酸修饰，且具有与PhaP相同功能的蛋白；B)将A)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有相同功能由A)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供了多种聚羟基脂肪酸PHA酯颗粒结合蛋白PhaP突变体，该突变体相对于野生型蛋白具有更强的乳化性，同时具有更高的耐热性，有更强的降低溶液界面表面张力的能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及聚羟基脂肪酸酯PHA颗粒结合蛋白PhaP突变体及其制备方法与应用。

背景技术

生物表面活性剂是一大类生物合成的双亲性分子(Mulligan等,Environ Pollut,133(2005),183-98；Khire等,Adv Exp Med Biol,672(2010),146-57)，包括低分子量的糖脂、脂肽、磷脂、中性类脂等和高分子量的含脂聚合物，如脂多糖、脂蛋白、多糖-蛋白-脂肪酸复合物等(Syldatk等，Z Naturforsch C，40(1985),61-7；Ogawa等,Biosci BiotechnolBiochem,64(2000),2466-8；Morita等，J Biosci Bioeng,104(2007),78-81；Wicke等，JNat Prod，63(2000),621-6)。这些分子结构基本由两部分组成，分别是疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、氨基酸和磷酸基等，以及是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。正是由于具有这种既亲油又亲水的双亲性分子结构，生物表面活性剂才能显著降低界面张力，或吸附在界面上形成紧密的定向排列来改变界面的亲水/亲油性能，使油/水两相得以很好的分散。其中最为代表的是糖脂类(Mata-Sandoval等，Microbiol Res,155(2001),249-56；Guilmanov等，Biotechnol Bioeng,77(2002),489-94；)。

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoic acids，简称PHA)是许多微生物在非平衡生长条件下合成的一种细胞内碳源和能源的贮藏性聚合物(Anderson等，Microbial Rev.,54(1990)450-472；Lee等，Biotech.Bioeng.,49(1996)1-14)。自然条件下的PHA在细菌体内是以不溶性脂肪颗粒的形式存在。PHA分子形成疏水核心，颗粒表面包裹着一层特殊的单层膜结构，由颗粒结合蛋白(PhaP)、调控蛋白(PhaR)、PHA合成酶(PhaC)、PHA降解酶(PhaZ)和单层磷脂膜等组成(Steinbüchel等，Can.J.Microbiol.41(1995)94-105；York等，J.Bacteriol.183(2001)2394-2397)。

PHA颗粒表面结合蛋白PhaP(以下简称PhaP)广泛存在于各种PHA合成菌中，虽然PhaP不是PHA合成所必需的，但会直接影响PHA包含体颗粒的尺寸大小和PHA合成积累的速率(Pieper-Fürst等,J.Bacteriol.,176(1994)4328-4337)。在Ralstonia eutropha中过表达自身的phaP基因观察到PHA的颗粒增多；而phaP基因缺失突变的R.eutropha，合成的PHA颗粒数目大大减少(Wieczorek等,J.Bacteriol.,177(1995)2425-2435)。在大肠杆菌中表达Rodococcus rubber的phaP使PHA颗粒数目增多、尺寸减小(Wieczorek等,J.Bacteriol.,177(1995)2425-2435)。PhaP被认为是一种两性蛋白，具有疏水区和亲水区，疏水区和PHA颗粒接触，亲水区朝向胞浆,这种结构有利于于其参与PHA颗粒的形成(Pieper-Fürst等,J.Bacterio1.,177(1995)2513-2523)。同时Aeromonas hydrophila菌种中的PhaP被报导具有生物表面活性剂的功能(Wei等，Applied Microbiology and Biotechnology.,91(2011)1037-1047)。