[发明专利]一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法

权利要求书

1.一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)制备单链DNA模板；(2)测序引物杂交：将测序引物与单链DNA模板结合；(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，所述的两核苷酸为从非标记或者标记的dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP、以及ddATPaS、ddCTP、ddTTP、ddGTP中选择的两种不同的核苷酸，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序；(4)每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸信息、以及核苷酸合成的数目信息，连续多个两核苷酸合成焦测序反应的测序信息构成测序图谱，由测序图谱确定分析样本的突变类型。

2.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，所述碱基连续突变序列是指相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变。

3.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，步骤(1)制备单链DNA模板按照如下方法进行：(1-1)采用一个5’端修饰生物素的引物对目的DNA片段进行PCR扩增；（1-2）将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠进行反应，生物素修饰的DNA链则固定到所述磁珠上，得到单链DNA模板。

4.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，当待测序列除了含有一种野生型DNA序列外，还含有一种突变型DNA序列时，选定两种序列相同的一个或者多个碱基作为一个峰高的基准，这个基准峰既可以选择单个核苷酸加入、也可以选择两个核苷酸加入的测序反应来确定，通过基准峰高及每个反应的峰高值计算待测序列中野生型DNA序列与突变型DNA序列的含量。

5.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，不同dNTPs、ddNTPs合成插入到DNA链后释放出相同的检测分子、且释放出检测分子的量与核苷酸合成的数目成线性关系，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。