[发明专利]一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法

说明书

本发明提供一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，这里，碱基连续突变序列是指序列中相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变，具体步骤为：（1）制备待测序列的单链DNA模板；（2）将测序引物与单链DNA模板结合；（3）对待测序列进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，通过有选择的几种具体的两核苷酸交替加入，完成连续的多个两核苷酸实时合成测序反应。该步骤中，根据分析样本所有可能的突变序列，设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。

技术领域

本发明涉及一种低成本单碱基核酸序列连续变化的实时合成测序检测方法，尤其涉及一种从可能的多位点变化中确定具体单碱基变化检测方法，属于生物技术领域。

技术背景

随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在诸多基因变异中，突变和SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志。通过获得与该疾病相关基因信息，对疾病预防、用药选择、新药研发、疾病预后等诸多个体化医药学领域具有十分关键的影响。因此，生物科技紧接着面临如何快速、可靠地对已知突变和SNP位点进行检测的问题，因此，这将标记着巨大的商业机会蕴涵在其中，并成为为众多商家看好的潜在的巨大市场。

与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比，基因突变(包括SNP)分析的基本方法在数量上已达20余种。种类繁多的分析方法，既反映了研究基因突变(包括SNP)分析方法在生物学和医学领域所受到的重视程度，也反映出任一单个方法尚无法满足后基因时代对基因突变(包括SNP)分析的要求。目前绝极大部分的分析方法均是针对单个位点进行分析，对于间隔很近的连续多个变化序列大部分的技术均无能为力，而这种碱基连续变化的序列数量也很多。例如Kras基因编码12、13位点的序列，对于所有人而言，除了正常序列外，还有7种突变的序列。然而，对于具体的一个人而言，它可能是只有一种正常(未突变)的DNA序列，或者除了正常(未突变)一种DNA序列外、还有一种突变(七种中可能的一种)DNA序列。因此，对一个具体样本而言，如何从8种可能的类型中快速、准确的判断出具体的分型，对于临床诊断无疑是有积极意义的。现有的分析方法中，Sanger测序无疑是这类核酸序列分析的“金标准”，但在定量分析上对丰度低于10％的核酸片段也无能为力；另外，其相对复杂的操作、仪器及其使用价格的相对昂贵也很难进行临床检测推广。DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法(肖鹏峰，等.中国发明专利：ZL 201210128598.3)虽然能对这类序列进行并行分析，但DNA芯片制备耗时过长，其总操作时间超过10小时，这样这个方法只适合大样本的科研分析，而不适合快速诸如临床诊断类的分析。焦测序技术是继Sanger测序后的测序技术，相对于Sanger测序，除了测序长度处于弱势外，在自动化程度，操作简易、价格上均有优势，便宜、且检测限更低，容易推广、十分适合临床检测上使用。现有的焦测序技术原理上如果能够通过优化核苷酸的加入顺序，使每种类型具有唯一、特征的测序图谱也就能够完成对这类序列的分析。然而，现有焦测序单个核苷酸的加入方式一方面由于受到单体(及其四个单体试剂仓)的限制，根据不同的序列很难优化出符合要求的单核苷酸加入顺序，另一方面即使优化出符合要求的加入顺序，其反应次数也可能很多，增加了分析的费用。

本发明针对现有技术分析碱基连续突变序列的不足，提出一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，从而确定分析样本的具体突变类型。该方法能够通过一次测序操作将样本在可能发生连续多个单碱基突变的某个具体突变确定，简化了操作步骤，减少分析费用。

发明内容