[发明专利]刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法

说明书

本发明公开了刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法，特点是刺参ITGB基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法为根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长；刺参ITGB蛋白序列如SEQIDNO.2所示，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参ITGB蛋白；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是对内毒素脂多糖具有较强的结合能力，对肽聚糖、甘露聚糖具有较弱的结合作用。

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法。

背景技术

β-整合素（β-Integrin，ITGB）为亲异性细胞粘附分子，主要介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用。几乎存在于动植物细胞中。功能研究揭示脊椎动物的整合素发挥着维持机体完整性的功能，并在细胞识别、信号传导和传递，细胞增殖、分化、成熟、运动、游走的调控，以及炎症、创伤修复、肿瘤转移等生理和病理过程中发挥重要作用。目前，对无脊椎动物整合素（Integrin）的研究主要集中在Integrin在机体早期发育过程的作用，有关无脊椎动物Integrin参与机体免疫的研究较少。已有的相关研究主要多集中在Integrin的β-亚基（ITGB）参与的免疫防御反应。Integrin对无脊椎动物的细菌性疾病有关，Integrin可能通过与细菌上带有RGD结构域的配体结合，实现机体免疫细胞对细菌的吞噬和包囊作用，这在某种海洋无脊椎动物中已经被验证。例如虐蚊的Integrin具有吞噬大肠杆菌的功能(Ying et al., 2012), 此外，在牡蛎Integrin的研究中，病原相关分子模式（PAMPs）结合分析表明Integrin重组蛋白对脂多糖（LPS）有一定的结合活性，对肽聚糖（PGN）、甘露聚糖（Mannan）结合活性却明显偏低。通过与之前牡蛎的PAMPs结合实验对比，我们发现在相同浓度Integrin与3种内毒素孵育的条件下，刺参整合素（AjITGB）对LPS的结合活性是牡蛎结合活性的2倍，显示了更强的LPS结合活性，而刺参整合素对PGN，Mannan的结合活性也很低，表明了其也有对内毒素结合上的特异性。刺参整合素在PAMPs结合上的优越性，在刺参病害的防治中更能发挥重要的作用。

刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由病原菌引发的疾病严重制约了该产业的健康持续发展。目前对刺参病害的解决办法主要是发病以后的救治，而无法做到病前的预防和发现，此类做法的结果往往会对刺参养殖业造成很大的损失，因此，筛选特异性好, 结合活性强的革兰氏阴性菌结合分子是在必行,同时，通过构建水产动物整合素基因表达工程菌，从而产生工业化、高产量的刺参整合素，通过向患病刺参的生活环境中添加目的蛋白，在刺参自身产生整合素的基础上增加了整合素对阴性致病菌的结合能力，从而提升刺参机体的免疫力，可以为刺参的发病提供一种解决手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法，表达的重组刺参β-整合素蛋白对脂多糖具有更强的结合活性，对肽聚糖、甘露聚糖结合活性较低。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种刺参ITGB基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

2、上述刺参ITGB基因的克隆方法，根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下：