[发明专利]刺参ITGB基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法

权利要求书

1.一种刺参ITGB基因，其特征在于该基因为SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述的刺参ITGB基因的克隆方法，其特征在于：根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下：

(1)通过对灿烂弧菌诱导刺参血细胞cDNA文库的表达序列标签分析，发现了多条编码ITGB基因的表达序列标签序列，选取编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆；

(2)RACE引物设计：根据编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：GGTTCATTGTCAAATCGGAG，3’上游特异性引物2：GATTACGTCGCTCTGGTCCA，5’下游特异性引物1：CCAACAATTCTGCAACCTCCG，

5’下游特异性引物2：TGCAACAAGGGGCACTTGGAG,扩增3’接头引物Adaptor3：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5’接头引物Adaptor5：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA；

(3)RACE扩增获取ITGB基因全长序列，具体步骤如下：

a.总RNA提取：取刺参体腔液制备得到RNA提取液；

b.3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取PCR稀释后的产物1ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带；

c.5’-RACE扩增：将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5’下游特异性引物1和Adaptor5进行PCR扩增，取PCR产物稀释后1ul作为模板，再用5’下游特异性引物2和Adaptor5进行PCR得到5’端目的条带；

d.将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得刺参ITGB基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示，其中LB平板培养基配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

3.根据权利要求2所述的一种刺参ITGB基因的克隆方法，其特征在于RACE扩增反应体系：模板1.0μL，10×PCR缓冲液2.5μL，浓度25mM的MgCl₂ 2.0μL，浓度10mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的特异性引物1.0μL，浓度10μM的接头引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：15.3μL；扩增条件：94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

4.一种权利要求1所述的刺参ITGB基因的编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。