[发明专利]一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法。

背景技术

流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染，具有传染性强，发病率高，容易引起暴发流行或大流行等特点。特别是近年来，新型流感不断爆发，给人类健康带来了严重的危害。神经氨酸酶是流感病毒表面一种重要的病毒表面糖蛋白，具有糖苷外切酶活性，可以水解唾液酸(sialicacid)残基与邻近寡糖之间的α-糖苷键。协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色，因而神经氨酸酶是流感治疗药物的主要作用靶点之一。神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase，NA)是目前各国普遍采用治疗流感的药物。然而，已有的抗流感药物仍然存在数量少、疗效不理想且不良反应较大等特点，急需开发高效，低毒，天然的新型神经氨酸酶抑制剂。

紫草(Lithospermiun erythrorhizon)是紫草科(Boraginaceae)植物新疆紫草(Amebia euchroma(Royte)Johnst.)或内蒙紫草(Arnebia guttata Bunge)的干燥根，在我国有悠久的药用历史。其味甘、咸，性寒，归心、肝经。有活血凉血，清热，解毒、透疹等功效。到目前为止，还没有从紫草中发现神经氨酸酶抑制剂并以其为指标对紫草进行质量控制的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种从紫草中分离制备具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法，步骤如下：

(1)以石油醚作为提取溶剂，制备得到紫草提取液；

(2)将紫草提取液与神经氨酸酶混匀，孵育，孵育后超滤离心，离心后加入甲醇使酶变性，释放出结合的化合物，HPLC检测；以变性神经氨酸酶作为对照，通过对比HPLC图谱筛选出具有神经氨酸酶抑制活性的化合物；

(3)利用半制备色谱制备筛选出的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物。

步骤(1)中，所述紫草提取液的制备方法为：将紫草与石油醚按料液比为1:80-1:120，优选为1:100，混合，超声提取20-40min(优选为30min)后，蒸干滤液，用乙醇和MES缓冲液复溶后过膜待用，作为紫草提取液。

步骤(2)中，紫草提取液和神经氨酸酶加入的体积比为1:4-6，优选为1:5。本发明综合考虑到紫草的提取溶剂对酶反应的影响以及反应体系中神经氨酸酶的终浓度，确定紫草提取液和神经氨酸酶加入的体积比为1:4-1:6；当体积比高于1:4时，神经氨酸酶浓度较低,筛选效果不明显；体积低于1:6时，反应体系中活性成分含量过低与神经氨酸酶结合差异较小，均不利于筛选的进行。

步骤(2)中，孵育的条件为：37℃恒温孵育30min。

步骤(2)中，所述超滤离心的操作为：将紫草提取液和神经氨酸酶反应后的溶液移至超滤离心管中，所述超滤离心管的截留分子量为100KD，7000-9000r/min离心5-10min，再用MES缓冲液离心冲洗，以除去未结合的小分子。

步骤(2)中，筛选具有神经氨酸酶抑制活性的化合物的方法为：通过对比紫草提取液与神经氨酸酶反应后的HPLC图以及紫草提取液与变性神经氨酸酶反应后的HPLC图，HPLC图谱发生明显变化的色谱峰所对应的化合物即为潜在的神经氨酸酶抑制剂。

步骤(3)中，所述半制备色谱的制备条件为：紫草提取液的进样量为400-600μL，乙腈：水＝80:20作为洗脱流动相，流速为5-7mL/min，检测波长为280nm。

步骤(3)中，半制备色谱的色谱柱优选为Shim-pack Prep-ODS(H)KIT色谱柱。

上述方法中，提取溶剂的选择对制备得到的紫草提取液的活性影响很大，本发明在试验过程中选择了多种提取溶剂对紫草进行提取，将不同提取溶剂得到的紫草提取液进行体外酶活验证，结果发现，不同提取溶剂得到的紫草提取液对神经氨酸酶的抑制活性差别显著，以石油醚作为提取溶剂得到的紫草提取液，其对神经氨酸酶的抑制活性最高，达45.67±0.71％以上。说明以石油醚作为提取溶剂可以对紫草中的具有神经氨酸酶抑制活性的化合物进行有效的提取。

采用本发明的方法可以制备得到五种具有神经氨酸酶抑制活性的化合物，分别为阿卡宁、乙酰阿卡宁、异丁酰阿卡宁、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰阿卡宁。化合物的结构式如下：