[发明专利]基于代谢物及基因表达筛选三七皂苷合成关键基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及三七中三萜皂苷合成途径关键基因的筛选，具体的是结合一年生三七 代谢物含量及三萜皂苷合成途径关键基因的表达量进行典型关联分析(canonical correlationanalysis)，筛选出三七中对皂苷含量贡献度较大的三萜皂苷合成途径关键 基因。

背景技术

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属植物，是我国传统珍 贵药材，其主要生理活性成分为三七皂苷。三七的应用在古代主要作为金创要药，用于体内 外各种出血及跌打损伤、瘀滞肿痛的治疗。现代药理学研究表明三七总皂苷和部分单体皂 苷在血液及心血管系统、系统代谢、免疫及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好的生理活性，其多 方面的药理作用及保健功能越来越受到人们的重视。目前三七皂苷的主要来源是从栽培三 七提取得到的，然而三七为多年生草本植物，生长周期长，且生长条件苛刻、地理分布窄，加 之病虫害严重、连作障碍、农药残留等问题，其产量已难以满足快速增长的市场需求。

近年来，针对药用植物次生代谢产物的基因调控已成为分子生物学研究的热点， 而皂苷类物质是植物次生代谢产物的重要组成部分，其含量和组成主要取决于生物合成关 键基因在细胞中的表达水平。在植物细胞中，萜类化合物主要来源于两个前体物质，异戊烯 基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径 和质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径都能够产生IPP和DMAPP，且两条途径 所产生的IPP可以穿过质体膜互为对方所用。IPP分子和两个DMAPP分子在法尼基焦磷酸合 酶(FPS)的作用下生成法尼基焦磷酸(FPP)，两个FPP分子在鲨烯合酶(SQS)的作用下以头- 头方式还原偶联生成三萜类物质的前体鲨烯。随后，鲨烯在鲨烯环氧酶(SE)的作用下氧化 成2，3-氧化鲨烯，达玛烷二醇合成酶(DS)催化2，3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇。达玛烯二 醇是达玛烷型四环三萜皂苷类的骨架，在细胞色素P450单加氧酶及多种糖基转移酶的作用 下最终形成不同类型的达玛烷型四环三萜皂苷。目前，植物三萜皂苷合成途径中的一些关 键酶基因已在人参属植物中克隆和鉴定，研究证实它们的表达对三萜皂苷合成起着重要调 控作用。此外，Niu等人对FPS，SS，SE和DS等基因在四年生三七开花期的表达进行了分析，为 进一步阐明皂苷类物质在三七中的合成机制打下了基础。

本发明以探索三七中三萜皂苷合成关键酶基因表达水平和代谢物含量的关联性 为出发点，应用高效液相色谱-质谱联用系统对一年生三七不同部位的代谢物含量进行了 分析，同时利用荧光定量PCR技术对其皂苷合成途径关键酶基因表达量进行定量分析，并且 通过典型关联分析构建了三七基因-代谢物相关图，对关键基因进行了筛选。在本发明之 前，尚未出现涉及基于三萜皂苷含量及其合成途径关键基因表达量对三七三萜皂苷合成关 键基因进行筛选的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于构建三七生长发育早期皂苷合成关键基因和代谢物含量的关 系网络，筛选三七植物中对皂苷合成有重要作用的关键基因。

为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案包括下列步骤：

1)分析一年生三七不同部位皂苷类物质代谢轮廓。

2)测定皂苷合成途径关键基因在三七不同部位的表达。

3)构建基因-代谢物关系网络，筛选三七中皂苷合成关键基因。

上述方法中，所述三七不同部位为一年生三七的叶、叶柄及根部。

步骤1)所述分析皂苷类物质代谢轮廓是采用高效液相色谱-质谱联用系统对不同 部位样品甲醇提取物进行检测，使用内标法通过标准曲线进行定量。分析方法参照Li等人 “GlobalanalysisofchemicalconstituentsinShengmaiinjectionusinghigh performanceliquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry”论文 中报道的皂苷定量方法。