[发明专利]一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于谷物和饲料中真菌毒素残留检测分析技术领域。具体而言，本发明涉及一种 玉米赤霉烯酮的免疫亲和层析柱及其制备方法和用途。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌 种产生的有毒代谢产物。1962年Stob等首先从发霉的玉米中分离得到了该毒素，命名为玉米 赤霉烯酮。

ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品如饲料等。Toshitsugu对19 个国家和地区的谷物、食品及饲料中所含的ZEN进行了调查发现，包括中国、阿根廷、加拿 大、波兰及也门等众多国家和地区的样品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制 品等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN对动物 及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后， 会引起雌性激素中毒症。造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统，免 疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。SchoentalR在进行致癌试验时发现，试 验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿瘤；此外，试验组和对照组大鼠还发生了乳腺纤维瘤、 腺瘤、腺癌、垂体腺癌、睾丸间质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况 发生，这些肿瘤所涉及的器官表明，它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此认为， 它们是由污染饲料的ZEN或其代谢产物引起的。

玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液 相色谱法(HPLC)。但是，目前所用的确证方法对样品要求高，前处理复杂，限制了监测的效 率。实际工作中，由于生物样本的成分复杂，而且大多数取样量很少，这对分析方法的特异 性和灵敏度提出了很高的要求。因此，有必要建立一种操作快捷，且具有很高的特异性和灵 敏度的方法。

免疫亲和层析技术是一种即免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质上是一 项效率高、提纯物质纯度高、快速的技术，可以使免疫检恻技术(如ELISA等)和层析技术在特 异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品的不足。

免疫亲和柱是上个世纪90年代在分析领域中得到应用的技术，但用免疫亲和柱提取样品 中的玉米赤霉烯酮未见报道。因此，本发明人通过大量试验，研制成功了一种具有高特异性 和灵敏度且操作快捷的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。

发明内容

本发明目的是提供一种快速提取玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱及其制备方法和用途。

本发明的原理是根据抗原抗体的特异性反应和可解离的特性，用玉米赤霉烯酮抗体提取 谷物和饲料中的玉米赤霉烯酮残留。

一方面，本发明提供了一种制备玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的方法，该方法包括下列步骤：

该方法包括下列步骤：

a)称取CNBractiveSepharose4B柱料1g，加入1mMHCl溶液10ml，浸泡30min，使之溶 胀。

b)然后以3000～8000r/min转速离心2～10min分离柱料，用0.1MPH9.0CB缓冲液洗涤溶 胀的基质3～5次，每次加入缓冲液10ml，以5000r/min离心10min分离柱料。

c)向溶胀好的柱料中加入抗体30mg，再加入0.1MPH9.0CB缓冲液10ml，于37℃条件 下150r/min震荡反应1h。

d)离心分离柱料，用0.1MPH8.3NaHCO₃缓冲液洗柱料3～5次，10ml/次。

e)加入含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl溶液10ml于结合有抗体的柱料中，4℃过夜 或者37℃，150r/min反应2h封闭未结合位点。

f)用含0.5MNaCl的0.1MPH4.0的醋酸钠洗脱液与含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl 溶液交替洗涤3～5遍，最终用含0.5MNaCl的0.1MPH8.0的Tris-HCl洗脱液10ml复溶。

g)按每支1ml抗体结合凝胶溶液进行装柱，加20％的乙醇保存液，4～8℃，可保存一年以 上。