[发明专利]一种促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖制备方法

权利要求书

1.唾液酸化浒苔寡糖在制备改善肠道菌群的药品或保健品上的应用，所述唾液酸化浒苔寡糖的制备方法，包括如下步骤：

（1）将浒苔干燥后超微粉碎过80-100目筛得干粉末，向浒苔干粉末中加入体积浓度60-80%乙醇回流提取1-2 h，干粉重量g与乙醇体积mL比为1:20-30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干，粉碎得到干燥脱脂的浒苔粉末；

（2）向步骤（1）制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量g与蒸馏水mL体积比为1:20-25，60-70℃萃取温度下450-600 W微波辅助提取2-3 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，抽滤，滤液减压浓缩至原体积的3-8%，真空冷冻干燥后粉碎；

（3）向步骤（2）所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量g与蒸馏水mL体积比为1:10-20，进行搅拌复溶，用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种或几种除蛋白5-8次；

（4）将步骤（3）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量g与洗脱液mL按重量体积比1:30-50去除色素，将活性炭与洗脱液于摇床中60-80 r/min振荡1-2h，6000-8000rpm离心20-30 min，收集上清液；

（5）将步骤（4）得到的提上清液旋蒸浓缩至原体积的3-8%，按体积比1:3-4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4-10℃条件下静置24 h，6000-8000rpm离心20-30 min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔寡糖的固体粉末；

（6）将步骤（5）中浒苔寡糖，按干粉重量mg与蒸馏水mL体积比为1:5-10溶解，溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37-40℃及转速为60-80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5；浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未唾液酸化浒苔寡糖精制品；

（7）步骤（6）得到的浒苔寡糖精制品按质量mg与体积mL比1:0.5-1.0溶解于蒸馏水中，将唾液酸转移酶加入到反应体系中进行生物反应，唾液酸转移酶用量mg与反应体系按质量与体积mL比1:3-5，反应体系中浒苔寡糖与胞苷一磷酸--N-乙酰神经氨酸质量浓度比1:1.0-1.5，MgCl₂质量终浓度为15-20 mM，pH6.5-8.0，置于35-40℃温度，80-100rmp摇床条件下反应24-36h；

（8）将步骤（7）反应体系按体积比1:1添加体积浓度95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，6000-8000rpm离心20-30 min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到唾液酸化浒苔功能性寡糖粗品；

（9）将步骤（8）所得粗品溶解后过Bio-Gel P-2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3,5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分；

（10）将步骤（9）中收集的浒苔寡糖组分溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到唾液酸化浒苔寡糖。