[发明专利]一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用，特别涉 及一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用。

背景技术

神经生长因子(即NerveGrowthFactor，简称NGF)是神经营养素家 族的第一位成员，它由Cohen和Levi-Montalcini在1954年发现,并在随后 的研究中阐明了其功能。Cohen和Levi-Montalcini因此获得了1986年的 诺贝尔医学或生理奖。NGF不但对神经细胞的增殖和分化有重要作用，还 对非神经细胞，例如免疫细胞、成纤维细胞、胰腺细胞和心肌细胞等的生 长和活性都有重要功能。因此，NGF对神经性和非神经性疾病都有良好的 潜在治疗作用。

因为鼠神经生长因子即鼠源NGF(mouseNGF,mNGF)和人神经生长 因子即人源NGF(humanNGF,hNGF)在氨基酸序列上有85％的同源性，并 且许多研究已经报道鼠源NGF对治疗各种神经损伤或退化疾病有明显的效 果，从雄性小鼠的颌下腺纯化而来的鼠源NGF在2003年已被中国药监局 批准用于治疗人神经损伤和退化相关疾病。目前，在中国药品市场上，鼠 源NGF的价格约为1000元/毫克，2015年的销售总量约为5百万毫克，产 量远远不足以满足市场需求。而且，最新的研究发现鼠源NGF和人源NGF 在生理、生化和生物特性上存在显著的差异，并且在人细胞中鼠源NGF的 生物活性显著低于人源NGF。此外，由于鼠源NGF对人来说是一种外源 蛋白，在使用鼠源NGF进行治疗可能会导致病人产生免疫反应，不太安全。

为了消除鼠源NGF用于人类治疗时带来的上述问题，已经有许多研究 尝试通过大肠杆菌、酵母、昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达系统来生产人 源NGF。但是这些细胞系统表达人源NGF的产量通常较低，并且其中一些 系统无法对其所合成的人源NGF提供正确的翻译后修饰，影响人源NGF 的药用效果。同时，已有团队尝试利用转基因兔的乳腺作为生物反应器生 产人源NGF。但乳腺作为生物反应器存在如下缺陷：1)只有性成熟后并且 处在哺乳期的雌性动物才能分泌乳汁；2)乳汁的分泌量有限；3)乳汁含 有大量的内源蛋白，不利于从乳汁中纯化出所特异表达的外源蛋白即人源 NGF。

发明内容

本发明的目的是提供一种转人神经生长因子基因的小鼠，通过转基因 方法将人源NGF序列插入小鼠第5号染色体上，并获得能在第5号染色体 上稳定遗传人源NGF基因序列和在唾液腺组织特异表达具有生物活性的人 源NGF的转人神经生长因子基因的小鼠，并利用该转人神经生长因子基因 的小鼠唾液腺作为生物反应器生产人源NGF药物，且从转人神经生长因子 基因的小鼠分泌的唾液中分离纯化出人源NGF，并将人源NGF应用于人类 疾病的治疗。由于小鼠唾液分泌量大，产生的人源NGF也多，而且唾液中 内源蛋白较少，便于人源NGF的分离纯化；且唾液腺能对NGF产生正确 的翻译后修饰，产生的NGF是人源化的，其在人类疾病治疗时不会产生免 疫反应，更加安全，因此可以解决上述问题。

根据本发明的一个方面，提供了转人神经生长因子基因的小鼠，该转 人神经生长因子基因的小鼠的基因组中包含人源NGF基因序列，且该转人 神经生长因子基因的小鼠唾液腺特异表达人源NGF。由此，该转人神经生 长因子基因的小鼠可以通过唾液分泌来产生人源NGF，再对唾液中人源 NGF进行分离提纯，得到纯化后的人源NGF并可用于人类疾病的治疗。该 转人神经生长因子基因的小鼠可以通过繁殖来获得数量庞大的家系，并源 源不断的产生唾液，从而获得更多的人源NGF，而且能在唾液腺中进行正 确的翻译后修饰，以及唾液中内源蛋白较少便于人源NGF的分离纯化。而 该人源NGF是人源化的，在用于人类疾病治疗时不会产生免疫反应，更加 安全。

在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列如SEQIDNO:1所示。

在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列整合在转人神经生长 因子基因的小鼠的第5号染色体上。