[发明专利]梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及梅毒特异性总抗体的检测，尤其是涉及梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方 法。

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒的防 控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。

梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种([1]林丽蓉,杨波,潘锡涛,等.潜在的血源传 播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010，20(10)：1491-1494)：

(1)病原学检测：梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视野显 微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒螺旋 体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。

(2)抗体检测试验：梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查，现有 的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率较高。

用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47为 主([2]Lin,L.R.,Z.G.Fu,etal."Developmentofacolloidal gold-immunochromatographyassaytodetectimmunoglobulinGantibodiestoTreponema pallidumwithTPN17andTPN47."Diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease. 2010.68(3):193-200.)，检测方法包括生物素亲和素检测法(中国专利CN201410410641.4)、 荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验等方法，这些检测方法的结果判断需要特殊的仪器设备(前者 需要酶标仪而后者不仅需要荧光显微镜还需要有经验丰富的技术人员进行结果判读，因此在 基层或边远地区，急需一种灵敏度和特异性较高的梅毒螺旋体特异性抗体检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强 的梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法。

本发明包括如下步骤：

1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表 达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；

2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位，将抗原混合物加至硝酸纤 维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭，将封闭后的硝酸 纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放 于阴晾干燥处备用；

3)以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分 泌抗人Ig单克隆抗体；

4)采用过碘酸钠法进行抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；

5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置 于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min；

6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min，再 用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

8)加入显色剂，放置后再用磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；

9)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。

在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔可采用直径6mm的圆形打 孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔；所述抗原混合物的用量可为0.5μL；所述奶 粉可采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉；所述封闭的时间可为30min；所述磷酸盐缓冲液 可采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。

在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷 酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。

在步骤7)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷 酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。