[发明专利]梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法

权利要求书

1.梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表 达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；

2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位，将抗原混合物加至硝酸纤 维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭，将封闭后的硝酸 纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放 于阴晾干燥处备用；

3)以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分 泌抗人Ig单克隆抗体；

4)采用过碘酸钠法进行抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；

5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置 于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min；

6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min，再 用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

8)加入显色剂，放置后再用磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；

9)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。

2.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中， 所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔是采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的 光滑面上压迹成圆形小孔。

3.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中， 所述抗原混合物的用量为0.5μL。

4.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中， 所述奶粉采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉。

5.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中， 所述封闭的时间为30min。

6.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中， 所述磷酸盐缓冲液采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗 3次,每次2min。

7.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤6)中， 所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂 洗可漂洗3次,每次2min。

8.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤7)中， 所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂 洗可漂洗3次,每次2min。

9.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中， 所述显色剂采用3,3-二氨基苯联胺；显色剂的加入量可为50μL；所述3,3-二氨基苯联胺可 按50mg3,3-二氨基苯联胺加入摩尔比0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。

10.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8) 中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。