[发明专利]一种检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，利用基因组测序和核内复制回交相结合，快速确认重复大片段基因组DNA所在染色体位置。本发明所述核内复制回交方法可高效、快速检测酿酒酵母染色体大片段重复基因组DNA所在染色体位置，并进行修复，删除大片段重复基因组DNA，无需精确确认大片段重复位点所在位置，无需对待检测酿酒酵母进行繁琐的实验数据分析工作，操作简单，实验周期短。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酵母细胞自身具备高效的同源重组特性(Ma,H.,et al.Gene(1987),58,201-216)，因而被广泛的应用于质粒构建、基因敲除乃至基因组构建的研究当中(Gibson,D.G.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(2008).105,20404-20409)。人工合成酿酒酵母基因组项目(Sc2.0)的研究人员通过将大量长约3kb的DNA片段转化进入到酿酒酵母细胞中，利用酿酒酵母自身的同源重组特性将野生型染色体逐步替换为一条全新的人工设计的染色体(Annaluru,N.,et al.Science(2014)344,55-58)。

酿酒酵母高效的同源重组特性为DNA片段的整合提供了便利，同时也有可能导致外源DNA片段的重复整合形成多拷贝DNA，甚至错误整合至非目标位点，从而使得酵母菌株的生长状况变差，影响相关研究。基因敲除为解决外源DNA片段错误整合的传统方法，即首先将营养标记表达盒整合至待目标位点来敲除错误整合的DNA片段，然后再利用正确的DNA片段敲除营养标记表达盒进而修复DNA多拷贝问题。但是，该方法需要精确确认待修复位点所在位置，实验数据分析工作非常繁琐；而在实际研究工作当中，往往并没有必要确认错误整合发生的精确位置。因此，快速检测高拷贝DNA发生位置并进行修复将为酵母基因操作提供便利条件。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题提供一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，包括：

步骤A、对待测酿酒酵母菌株进行基因组测序；

步骤B、在待测酿酒酵母菌株相反交配型的野生型酵母菌株对应染色体着丝粒处添加半乳糖启动子；

步骤C、利用核内复制回交(endoreduplication backcross)获得全新的单倍体酵母菌株；

步骤D、对步骤C获得全新的单倍体酵母菌株进行基因组测序，与待测酿酒酵母菌株的基因组测序结果比较，确定大片段重复的位置。

其中，本发明所述检测方法中步骤C具体包括以下步骤：

1)将待测酿酒酵母菌株与所述添加半乳糖启动子的野生型酵母菌株进行融合，获得二倍体酵母菌株；

2)半乳糖诱导二倍体菌株中GAL1启动子表达，获得只携带源染色体的二倍体酿酒酵母菌株；

3)对步骤2)获得酿酒酵母菌株进行生孢实验并进行孢子拆分。

在一些实施方案中，本发明所述快速检测酿酒酵母染色体大片段重复的位置的方法，分析比较结果，全新的单倍体酵母菌株的基因组测序结果中存在大片段重复DNA，大片段重复存在于待测酿酒酵母菌株染色体上。