[发明专利]草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法有效

申请号：	201610097677.0	申请日：	2016-02-23
公开（公告）号：	CN105603095B	公开（公告）日：	2017-07-18
发明（设计）人：	张吉宇;吴凡;骆凯;张代玉;王彦荣	申请（专利权）人：	兰州大学
主分类号：	C12Q1/68	分类号：	C12Q1/68;C12N15/11
代理公司：	兰州振华专利代理有限责任公司62102	代理人：	张真
地址：	730000 ***	国省代码：	甘肃;62
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摘要：
搜索关键词：	草木 18 物种植物条形码目标基因及其制备方法
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【权利要求书】：

1.一种草木樨属18个植物条形码的目标条形码基因的制备方法，其特征在于包括有以下步骤：

A.通过草木樨的不同生物学特性初步鉴定18个种；

B.幼苗DNA的提取；

C.目标 DNA 条形码基因的筛选：通过预实验筛选最终确定 ITS、psbA-trnH、rbcL、 matK、trnL 为目标条形码基因；

D.目标DNA条形码基因片段的扩增与测序；

通过预实验确定 5 个目标基因的反应体系和扩增条件；

总反应体系为 25 µl：2×Reaction Mix 12.25 µl, Golden DNA Polymerase 0.25 µl,正反向引物各 2.5 µl, ddH2O 5 µl,2)中 DNA 模板 2.5 µl；

基于 ITS 基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)：GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG；反向基因(5′-3′)：RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA；

基于 psbA-trnH 基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向基因(5′-3′)：CGCGCATGGTGGATTCACAAATC；

基于 rbcL 基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)；AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT；反向基因(5′-3′)：TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA；

基于 matK 基因的特异引物对为，正向基因 (5 ′ -3 ′ ) ； CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC ；反向基因 (5 ′ -3 ′ ) ： GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC；

基于 trnL 基因的特异引物对为，正向基因(5′-3′)；CGAAATCGGTAGACGCTACG；反向基因(5′-3′)：ATTTGAACTGGTGACACGAG；

使用上述特异引物对对草木樨属18个物种植物基因片段进行扩增与测序；

E.测序结果的核查；

F.序列比对、编辑、质量核查、目标DNA条形码序列建树；

G.标准分类DNA条形码基因及对应序列的确认；

H.标准分类DNA条形码基因及对应序列准确性验证；

所述的步骤F，包括基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于MEGA软件最小进化原理的Neighbor-Joining算法和no of difference方法构建聚类图；

所述的步骤G中所述的草木樨属18个物种植物标准分类DNA条形码基因对应序列是以下序列1到序列18所示的DNA片段：

序列1的名称为：M.wolgicus_A1_matK，序列为：

ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactacca

aaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatt

tttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttac

gattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatc

ttgtagaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctca

ttcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttga

tgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctc

aaccaagaac gatcaatata aaccgattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctatt

ttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttc

taatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagat

ccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctggg

ccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct

序列2的名称为：M.tauricus_A36_matK，序列为：