[发明专利]肿瘤原代细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤原代细胞培养技术，具体地说，涉及一种新型高效的肿瘤原代细胞培养方法。

背景技术

恶性肿瘤是一类发病率和死亡率都非常高的疾病，严重危害着人类的生命和健康，是导致残疾和早死的主要疾病之一，在35～59岁年龄组中，恶性肿瘤居死因第一位。资料显示，2015年我国共有429.2万新发肿瘤年病例和281.4万癌症死亡病例。肿瘤发病率以3％的速度递增且呈年轻化趋势，居各类疾病中死亡率之最。

目前恶性肿瘤的治疗包括手术，放疗，化疗，内分泌治疗和生物免疫治疗，

其中以前三种为主，化疗作为一种全身性的治疗手段，因能广泛的杀灭患者体内的肿瘤细胞，提高患者的生存率和生存期，而在治疗中占有非常重要的地位。随着医学的发展，化疗已经不再是单纯起姑息性治疗作用的手段，正在从姑息向根治过渡，1998年，世界卫生组织提出，使用适当，化疗在部分肿瘤(恶性滋养细胞肿瘤、急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、急性粒细胞白血病、胚胎性横纹肌肉瘤、小细胞肺癌和卵巢癌等)中已成为可以治愈肿瘤的根治性治疗手段。经辅助化疗后可能治愈的肿瘤有乳腺癌、成骨肉瘤、大肠癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤及肾母细胞瘤等。化疗在部分晚期肿瘤中起姑息性治疗作用，如延长患者生命、减轻症状和减少痛苦，如胃癌、食管癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、肾癌、前列腺癌、冠心病等。虽然化疗在肿瘤中占有非常重要的地位，但化疗常因伴有明显的毒副反应和副作用，而且化疗对于多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。其中，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致肿瘤化疗失败的常见因素，也是困扰肿瘤治疗的关键性难题。耐药问题是极为普遍的临床问题，据美国癌症协会估计，90％以上因肿瘤死亡的患者在不同程度上受到耐药影响。肿瘤细胞耐药分为原发性和获得性耐药两大类。目前临床上通常的做法是，根据国际肿瘤临床试验的循证研究结果，得知不同的化疗药物对不同肿瘤的治疗敏感性不同，即每一种肿瘤有相应有效的化疗药物敏感谱，从而选择疗效最高的化疗单药或多种药物组成的联合方案进行治疗。但在临床上经常碰到这样的情况，经循证研究公认为对某种肿瘤有效的治疗方案，而对有的患者却毫无效果。如阿霉素对浸润性乳腺癌是一种具有里程碑意义的治疗药物，但仍有50％的浸润性乳腺癌病人对这种药不敏感。又如健择，对非小细胞肺癌公认的疗效明显，但也有60％以上的病人疗效并不明显。专家认为，这是因为肿瘤是一个异质性、多形态、分化程度不等的细胞群体。肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异。即不同的肿瘤类型或同一类型的不同病人，甚至同一病人在不同的发病阶段，对化疗的敏感性并不完全相同，治疗效果差别也很大。至今还没有一种化疗药物或几种化疗药物的联合应用，能对某一种肿瘤100％有效。为此，建立一种像细菌敏感试验一样，通过相对可靠的敏感试验方法，对不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药。

目前常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性低于70％，约20％-35％的患者接受了不恰当的药物治疗。如果肿瘤治疗能够同病异治、因人而异、实施个体化治疗，将能够大大提高疗效，避免过度治疗和降低患者经济负担，减少医疗资源的浪费。因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。

目前主要的药敏检测方法都是基于原代肿瘤细胞培养成功的基础上。如ATP-生物荧光体外肿瘤药物敏感性检测技术(ATP-TCA)、四唑盐(MTT)比色法、细胞毒性差异染色法(DiSC)等。但常规的原代肿瘤细胞脱离体内环境后，在体外最初培养的24小时后，大部分细胞都会逐渐死亡飘浮，能够贴壁生长的细胞占极少比例，传统的原代肿瘤细胞培养，耗时较长，样品易污染，灵敏度较低等。这些缺点均会干扰实验结果的准确性，进而影响到化疗方案的正确选择和最终疗效。一定程度上限制了药敏试验的推广，使其陷入了迂回不前的局面。原代单细胞培养将成为此类方法的瓶颈,制约着此类方法的成功率和可靠性。

发明内容

本发明的目的是针对现有细胞培养技术中存在的不足，提供一种新型高效的肿瘤原代细胞培养方法。

为了实现本发明目的，本发明肿瘤原代细胞的培养方法，所述方法是在含0.1-10mM钙离子或0.8-30v/v％血清(或血清替代品)，并添加Rho激酶(ROCK1和ROCK2)抑制剂的标准培养基和饲养层细胞或细胞替代物中培养原代肿瘤细胞和/或饲养层细胞。