[发明专利]肿瘤原代细胞的培养方法

权利要求书

1.肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于，所述方法是在含 0.1-10mM钙离子或0.8-30v/v％血清，并添加Rho激酶抑制剂的标准培 养基和饲养层细胞或细胞替代物中培养原代肿瘤细胞和/或饲养层细 胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Rho激酶抑制 剂包括TGF-beta、EGFR、钙粘素、G蛋白、肌球蛋白磷酸酶抑制剂、 波形蛋白、LIMK、肌球蛋白轻链激酶、NHE、钠/氢交换蛋白-1或肌 球蛋白素中的至少一种；培养基中添加的Rho激酶抑制剂的终浓度为 5-15μmol/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述饲养层细 胞包括来自哺乳动物的脾细胞、巨噬胸腺细胞、纤维母细胞；所述细 胞替代物包括饲养层细胞提取物、条件培养基或甲醇固定的小鼠胚胎 成纤维细胞、纤连蛋白、胶原蛋白、吩噻嗪中的至少一种；所述条件 培养基是指培养过饲养层细胞的培养液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述饲养 层细胞是经过γ射线辐射或丝裂霉素C处理后，抑制了其增殖性，但仍 保持代谢活性的饲养层细胞，其制备方法如下：

(1)γ射线辐射：取饲养层细胞，吸去培养液，PBS清洗2次， 加入胰蛋白酶，于37℃消化2～10min，细胞脱离皿底时，终止消化， 制成单细胞悬液；将细胞悬液于1500r/min离心3min，弃上清；加入 2mL细胞培养液，用吸管吹打离散成高浓度细胞悬液；将细胞悬液转 移至20mL无菌血清瓶中，进行γ射线(10-40Gy)照射20-36h；照射 后的细胞悬液经离心后弃上清，即得；或

(2)丝裂霉素C：取饲养层细胞，吸去培养液，加入1-100μg/ml 丝裂霉素C，37℃、5％CO₂培养箱中培养1-5h后，用PBS清洗2次，加 入胰蛋白酶消化3～5min，终止消化；将细胞悬液移入离心管， 1500r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入细胞悬液重复离心1次， 即得。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述标准 培养基包括DMEM培养基、Ham'sF-12培养基、Ham'sF-10培养基、 RPMI1640培养基、Eagle'sBasalMedium、Eagle'sMinimumEssential Medium、HEPES、199培养基、MCDB131培养基、McCoy's5A培养 基、MEF培养基、ES培养基、D-Hank’s培养基，或它们中的两种或 两种以上培养基组合。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述标准 培养基中还添加有氨基酸、维生素、无机盐、腺嘌呤、乙醇胺、葡萄 糖、肝素、皮质醇、胰岛素、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙 酮酸钠、三碘甲状腺氨酸、胸苷、转铁蛋白、柠檬酸铁或硫酸亚铁盐 中的至少一种；

其中，所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L- 天冬氨酸、L-半胱氨酸或L-左旋谷氨酸中的至少一种；

所述维生素包括维生素H、维生素B6、维生素B2、维生素B1、 维生素B12、氯化胆碱、叶酸、肌醇或烟酰胺中的至少一种；

所述无机盐包括硫酸铜、硫酸铁、氯化钾、氯化镁、钠盐、硒盐、 硅盐、钼盐、钒盐、镍盐、锡盐或锌盐中的至少一种。