[发明专利]结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋 白及其制备方法和应用。

背景技术

大量结核感染病例的存在和常规药物对结核感染进行治疗面临着很大困境。尤其 是耐药结核分枝杆菌特别是多重耐药菌的出现对人类健康构成了极大威胁，这类耐药细菌 导致的结核面临无药可用的境地，已成为结核病防治的巨大障碍。如何有效地根治结核感 染特别是耐药结核感染已经成为当前许多国家结核病防治工作面对的难题。寻找新的有效 的抗结核分枝杆菌制剂已经成为刻不容缓的问题。

噬菌体制剂作为新型的治疗方法，受到越来越广泛的关注。噬菌体具有高度专一 的宿主选择性，噬菌体杀灭宿主菌具有高度特异性，不会影响其他菌群，不会破坏体内微生 态的平衡，也不引起胃肠道反应、过敏反应等。实验证明噬菌体治疗细菌感染具有很高的有 效性和安全性。噬菌体治疗细菌感染具有许多优势，尤其是耐药菌的感染。例如耐甲氧西林 的金黄色葡萄球菌(MRSA)的治疗是临床上面临的棘手的问题，Capparelli等人利用噬菌体 来控制MRSA的感染，取得了良好的效果，研究结果显示MRSA噬菌体在体内和体外都可以杀 灭巨噬细胞内部的MRSA。

目前噬菌体全菌治疗体内细菌感染遇到的最大瓶颈，一是较难实现体内靶向性给 药；二是机体免疫系统对噬菌体的清除也是噬菌体治疗中必须解决的一个重要问题。此外 机体免疫系统产生针对噬菌体的中和抗体，引起噬菌体失活，为了避免出现这一情况，需要 找到降低噬菌体免疫原性的方法。

噬菌体对宿主菌的溶解是由噬菌体自身溶菌蛋白介导的溶解系统完成的。溶菌蛋 白是一类细胞壁裂解酶类，它与细菌细胞壁的糖基特异性结合，发挥作用；而这种细胞壁糖 基具有种属特异性。为了克服活性噬菌体制剂的局限性，人们探索了提纯噬菌体的特异性 溶菌蛋白作为抗菌制剂治疗细菌感染。例如研究表明，纯化的噬菌体溶菌蛋白Cpl-1在肺炎 链球菌引起的心内膜炎和细菌性脑膜炎的试验中，显示出了良好的抗菌活性。噬菌体编码 的溶菌蛋白不仅能高效的杀灭耐药葡萄球菌属细菌引起的感染菌而且在体内无残留。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的较难实现体内靶向性 给药和产生噬菌体免疫原性最终会导致噬菌体失活的不足，提供一种具有靶向杀灭结核分 枝杆菌的来源于噬菌体的融合双组份溶菌蛋白。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌 蛋白的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是：提供一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌 蛋白在制备治疗结核分枝杆菌感染的药物中的用途。

为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是：将两段编码噬菌体溶菌蛋白 的基因序列在噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物作用下经过扩增、连接、构建载体、转 化、表达、纯化后制得结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白。所述噬菌体溶菌蛋白1引物为 包含以下序列的引物：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

所述噬菌体溶菌蛋白2引物为包含以下序列的引物：

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’

优选的，所述噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物为：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：