[发明专利]一种生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法

权利要求书

1.一种生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，包括以下步骤：

将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行诱导分化，形成生物工程视网膜神经支架，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；对培养到一定时期的生物工程视网膜神经支架上的神经样细胞进行全细胞记录模式离子通道电流记录，通过支架细胞电位检测反映生物工程视网膜神经支架神经基础功能。

2.根据权利要求1所述的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。

3.根据权利要求1所述的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，所述的诱导分化是在37℃、5％CO₂，饱和湿度下进行诱导分化。

4.根据权利要求1所述的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。

5.根据权利要求1所述的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，所述的全细胞记录模式离子通道电流记录，其灌流液成分为：NaCl124mmol/L，KCl2.5mmol/L，NaH₂PO₄1.25mmol/L，MgSO₄2.0mmol/L，CaCl₂2mmol/L，NaHCO₃26mmol/L，glucose10mmol/L，灌流液通以95％O₂+5％CO₂混合气体。

6.根据权利要求1所述的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，所述的全细胞记录模式离子通道电流记录，其电极液成分为：CsCl150mmol/L、EGTA11mmol/L,CaCl₂1mmol/L,MgCl₂1mmol/L,HEPES10mmol/L,用CsOH调pH至7.4，电压钳制保持电位为-80mV，去极化电压为-10～+40mV，步阶电压10mV，去极化钳制时间10～40ms。

7.根据权利要求1所述的生物工程视网膜神经支架细胞电位的测量方法，其特征在于，所述的对培养到一定时期的生物工程视网膜神经支架上的神经样细胞进行全细胞记录模式.离子通道电流记录是将培养到一定时期的生物工程视网膜神经支架上的神经样细胞，吸除其培养基，用PBS洗涤后，在细胞贴附式状态下给予电压脉冲刺激，检测生物工程视网膜神经支架整体细胞产生的电活动，从而记录到生物工程视网膜神经支架全细胞膜离子电流。