[发明专利]一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建、单抗及试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学测定分析领域，特别涉及一种胃泌素释放肽前体蛋白表达 载体的构建、单抗及试剂盒的制备方法。

背景技术

胃泌素释放肽前体(ProGRP)是小细胞肺癌的一个非常可靠的指标，具有 很好的灵敏度和特异性。肺癌早期无症状和症状轻微，2/3的患者在发现时已处 于扩散阶段，五年存活率小于5％，如能早期发现，通过手术治疗，五年存活率 高达70％－80％，ProGRP在小细胞肺癌早期就有可测浓度的分泌，所以该标志 物毫无疑问能用于高危患者的筛查。

ProGRP的释放不仅更多见于小细胞肺癌的癌细胞，而且还发现其在肿瘤和 器官的特异性方面优于其他生物标志物。ProGRP具有强大的鉴别诊断能力是因 为良性病变时ProGRP的产生量很少，其他癌症(非小细胞癌症和非神经内分泌 癌症)中也没有ProGRP产生，或者产生量很少。ProGRP在预测复发及转移可 能性方面的表现要优于NSE，并能取代NSE对小细胞肺癌的治疗进行监测。

但是，单纯大肠表达的ProGRP免疫原是半抗原，免疫原性很差，后期尝试 过将重组表达的ProGRP化学偶联大分子载体蛋白BSA或者KLH结构免疫活性 也是很差。

人体正常状态下少量表达HSP，其含量仅占总蛋白5％～10％，而且受自 身免疫调节网络作用，不会引起免疫应答反应。当病原体感染机体时，病原体相 对抗体及其机体针对病原体均可合成HSP，二者HSP同源性高于50％，由此 构成HSP在不同个体中介导抗感染免疫或自身免疫反应的基础。

热激蛋白融合表达蛋白是一种能增强所融合表达的蛋白免疫效果的一种表 达方法，但这种方法存在筛选抗体时用到的抗原需要另外制备的问题，且往往需 要额外的制备纯的蛋白来进行抗体筛选；而未采用融合表达的方法制备出的抗体 效价往往不高，需要很长时间才能筛选出较高效价的单抗。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明的目的是提供一种胃泌素释放肽前体蛋 白表达载体的构建，能够通过一次克隆表达，制备出高免疫原性的ProGRP和 HSPA6融合蛋白，ProGRP-HSPA6融合蛋白既可以作为免疫原，也可以很方便的 通过一步酶切制备出不含表达标签的纯ProGRP用于单抗鉴定及抗体筛选的蛋白 抗原。

本发明的另一目的是提供一种利用上述胃泌素释放肽前体蛋白表达载体制 备单抗的方法，利用ProGRP-HSPA6融合蛋白做为免疫原提高了免疫原性，增加 了免疫效果，很大程度的提高了抗体制备和筛选效率。

本发明的另一目的是提供一种胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，试 剂盒的制备周期短，所述试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中胃泌素释放肽前体 (ProGRP)水平，可以进行双抗体夹心法的磁粒子化学发光检测样本。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种胃泌素释放肽前体蛋白 表达载体的构建，包括如下步骤：

在HSPA6蛋白基因上引入肠激酶酶切位点序列，通过酶切位点将带肠激酶 酶切位点的HSPA6克隆到载体上，得到中间表达载体；再通过酶切位点将ProGRP 目的基因克隆到所述中间表达载体上，以构建得到ProGRP-HSPA6目的表达载 体。

作为进一步的优选，通过BamHI/NotI双酶切位点将带肠激酶酶切位点的 HSPA6克隆到载体上。

作为进一步的优选，通过NadI/BamHI双酶切位点将ProGRP目的基因克隆 到所述中间表达载体上。

作为进一步的优选，所述中间表达载体为PET-28a-HSPA6表达载体，所述 目的表达载体为PET-28a-ProGRP-HSPA6表达载体。

作为进一步的优选，根据uniprot蛋白数据库的基因序列合成ProGRP基因 片段。

利用上述胃泌素释放肽前体蛋白表达载体制备单抗的方法，包括如下步骤：

1)将ProGRP-HSPA6表达载体导入宿主；

2)采用IPTG诱导表达融合蛋白；

3)镍离子柱纯化得高纯度蛋白做为免疫原；

4)免疫动物；

5)取所述免疫动物的细胞制备融合细胞；筛选分泌单抗的杂交瘤细胞系， 建立单抗细胞株，并制备单抗腹水。