[发明专利]一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建、单抗及试剂盒的制备方法

权利要求书

1.一种胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建，其特征在于：包括如下步 骤：

在HSPA6蛋白基因上引入肠激酶酶切位点序列，通过酶切位点将带肠激酶 酶切位点的HSPA6克隆到载体上，得到中间表达载体；通过酶切位点将ProGRP 目的基因克隆到所述中间表达载体上，构建得到ProGRP-HSPA6目的表达载体。

2.根据权利要求1所述的胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建，其特征 在于：通过BamHI/NotI双酶切位点将带肠激酶酶切位点的HSPA6克隆到载体 上。

3.根据权利要求1所述的胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建，其特征 在于：通过NadI/BamHI双酶切位点将ProGRP目的基因克隆到所述中间表达载 体上。

4.根据权利要求1所述的胃泌素释放肽前体蛋白表达载体的构建，其特征 在于：所述中间表达载体为PET-28a-HSPA6表达载体，所述目的表达载体为 PET-28a-ProGRP-HSPA6表达载体。

5.利用权利要求1-4任一项所述的胃泌素释放肽前体蛋白表达载体制备单 抗的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将ProGRP-HSPA6表达载体导入宿主；

2)采用IPTG诱导表达融合蛋白；

3)镍离子柱纯化得高纯度蛋白做为免疫原；

4)免疫动物；

5)取所述免疫动物的细胞制备融合细胞；筛选分泌单抗的杂交瘤细胞系， 建立单抗细胞株，并制备单抗腹水。

6.根据权利要求5所述的制备单抗的方法，其特征在于：还包括步骤6) 抗体的筛选：利用肠激酶切掉HSPA6+ProGRP融合蛋白的HSPA6标签部分，得 到纯的ProGRP来筛选所述单抗。

7.一种胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下 步骤：

利用吖啶酯标记一如权利要求5或6所述的Pro-GRP单克隆抗体；

将另一如权利要求5或6所述的Pro-GRP单克隆抗体偶联磁粒子；

将样本、磁粒子偶联的所述Pro-GRP单克隆抗体及吖啶酯标记的所述 Pro-GRP单克隆抗体进行反应，形成抗体一抗原一抗体夹心复合体，制作成化学 发光试剂盒用于样本检测。

8.根据权利要求7所述的胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，其特 征在于：吖啶酯标记所述Pro-GRP单克隆抗体具体步骤如下：取一定量Pro-GRP 单克隆抗体，采用0.05mol/LpH9.5CB调整浓度为1mg/mL；按抗体：吖啶 酯＝1：10～20摩尔比加入已活化吖啶酯，室温反应0.5～1.0h；将反应液移至 透析袋，采用0.05mol/LpH9.5CB透析24h，加人等量甘油，放置～20℃以 下保存。

9.根据权利要求7所述的胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，其特 征在于：将所述单克隆抗体偶联磁粒子具体步骤如下：将磁粒子用50mmol/L NaCO₃-NaHCO₃pH9.6缓冲液稀释至适当浓度，按1mL磁粒子加1mL抗体的 比例进行固相，4℃搅拌过夜，磁分离器分离磁粒子，用pH7.4PBS反复洗涤3 次，加5g/LBSA封闭4℃搅伴过夜，磁分离器分离磁粒子，用pH7.4PBS洗3 次，加入磁微粒稳定剂，使微球浓度为5mg/mL。

10.根据权利要求7所述的胃泌素释放肽化学发光试剂盒的制备方法，其 特征在于：样本检测步骤如下：将形成的所述抗体一抗原一抗体夹心复合体反应 液置于一个磁场内，检测中的磁粒子将被吸附，通过洗涤，将未结合物冲洗除去； 注入第一化学发光激发液及第二化学发光激发液，检测其化学发光光子强度，用 双对数法，以发光值对Pro-GRP浓度作图，通过标准曲线对血清Pro-GRP浓度 进行测定。