[发明专利]检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的引物、检测试剂盒及其方法

权利要求书

1.检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的引物，其特征在于：

SVBV4上游引物为CTAACTATCTTACACAGGGAAC，SVBV4下游引物为 GTCCGATCTCATTACAAATCCA；

SVBV6上游引物为ATCATACAAGAAGACCGCAAC，SVBV6下游引物为 TTTCACCACTCTAGCTGCCTC。

2.检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于：包括，

步骤一.设计的引物为：

SVBV4上游引物为CTAACTATCTTACACAGGGAAC，SVBV4下游引物为 GTCCGATCTCATTACAAATCCA；

SVBV6上游引物为ATCATACAAGAAGACCGCAAC，SVBV6下游引物为 TTTCACCACTCTAGCTGCCTC；

步骤二.提取草莓样品的DNA，加入草莓样品DNA、设计的引物以PCR 法进行样品DNA的扩增和检测；

PCR的扩增参数为：94℃预变性90s，30个循环包括94℃变性30s、50℃ 退火30s、72℃延伸40s，最后72℃延伸5min；每25μL体系中，草莓样品DNA 的浓度为0.026-39ng/μl，引物浓度为0.4μM；

通过PCR反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳图样中含有以上两个基因 的目的条带确定草莓植株感染草莓镶脉病毒；若电泳图样中不含有以上两个基 因的目的条带确定草莓植株没有感染草莓镶脉病毒。

3.根据权利要求2所述的检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于： 步骤一和步骤二同时进行。

4.根据权利要求2所述的检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于： 步骤二中，提取草莓样品的DNA的方法：

A.65℃预热CTAB提取液；

B.取1g的草莓嫩叶片在液氮中研碎，转入离心管，随后加500μl已预热的 CTAB提取液，得混合液I；在65℃水浴锅中保温45min，期间颠倒至少一次；

C.用与混合液I等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液抽提1次，期间颠倒至少一 次，离心取上清液；

D.重复操作步骤C；

E.取上清液，加预冷过的异丙醇，异丙醇的体积为上清液体积的0.6-1倍， -20℃放置20min，离心弃上清液，用70％乙醇洗涤两次沉淀，待乙醇挥发后进 行下一步；

F.加入40μl无菌水或TE缓冲液溶解沉淀，加RNA酶至浓度为500U/μl， 得到的草莓样品的DNA，放入-20℃保存备用。

5.根据权利要求4所述的检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于： 步骤A中，CTAB提取液中含质量浓度为2‰的β-巯基乙醇。

6.根据权利要求4所述的检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于： 步骤C中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1。

7.根据权利要求4所述的检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于： 步骤C中，12000r/min离心10min，取上清液；

8.根据权利要求4所述的检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的方法，其特征在于： 步骤E中，8000r/min离心5min。

9.检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括SVBV4 上游引物为CTAACTATCTTACACAGGGAAC，SVBV4下游引物为 GTCCGATCTCATTACAAATCCA；

SVBV6上游引物为ATCATACAAGAAGACCGCAAC，SVBV6下游引物为 TTTCACCACTCTAGCTGCCTC。