[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法

说明书

本发明提供利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变。进一步地，通过遗传转化的方法将含有CRISPR/Cas9的载体转入携带目标基因的受体材料中，获得该目标基因定点突变的再生植株。利用本方法可实现对玉米基因组的定点突变，本方法具有实验周期短、操作简便等特点，利用不同靶向的CRISPR/Cas9系统可对不同目标基因进行定点定向改造，为玉米改良育种提供了新方法，对于改良玉米性状具有重大实际意义。

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法。

背景技术

随着生物技术的不断发展，越来越多的新型育种技术不断涌现。传统育种技术周期长，难以对目标形状作定点定向改良。近些年兴起的生物技术育种很大程度上缩短了育种周期，可有目的地引入新性状或改良固有性状。

CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/Cas是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统。它利用靶位点特异性的RNA指引Cas蛋白对靶位点序列进行修饰，进而在靶标序列上形成各种类型的突变。自2013年以来，CRISPR/Cas系统已经成功应用于人类、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、酵母、拟南芥及水稻、大豆等多个物种中。

在医学上，该系统可用于某些疾病的治疗。在基础生物学领域，该方法可用于基因功能研究。近年来有学者开始应用该系统对作物内源基因进行改良，用于产生新的育种材料。CRISPR/Cas系统由于其可对靶标位点进行特异性改变而受到高度关注，且定点改变后的作物在第二代即可获得突变基因纯合体，大大缩短了育种周期。玉米是世界上最重要的粮食和饲料作物，目前尚未发现在玉米育种中应用CRISPR/Cas系统的报道。在玉米种质改良上应用该技术具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法。

本发明的另一目的是提供上述方法在玉米基因定点突变育种中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法。为此，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变。

本发明中所述玉米包括自交种、杂交种、普通玉米、甜玉米、糯玉米等。优选地，所述玉米为祥249自交系。本发明中涉及的目标基因可以是本领域技术人员感兴趣的基因或有生物学功能的任何DNA序列，包括玉米基因组中任何有生物学功能的基因或DNA序列，或者是希望定点改良的任何基因，例如GFP基因。

针对玉米祥249自交系转基因植株中GFP基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-ACCGGGGTGGTGCCCATCC-3’。

前述的方法，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，构建得到载体Cas9-GFP-gRNA，用载体Cas9-GFP-gRNA转化玉米，实现对玉米GFP基因的定点突变/敲除。其中，载体Cas9-GFP-gRNA的全序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供所述方法在玉米基因定点突变育种中的应用。所述玉米包括但不限于祥249自交系。

所述应用包括以下步骤：

(1)将玉米的幼胚浸入携带CRISPR/Cas9和选择标记基因(例如CP4)的农杆菌菌液中侵染；