[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法

权利要求书

1.利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法，其特征在于，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变；

所述玉米为祥249自交系；

所述目标基因为GFP；其sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-accggggtggtgcccatcc-3’；

用载体Cas9-GFP-gRNA转化玉米，载体Cas9-GFP-gRNA的全序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述方法在玉米基因定点突变育种中的应用，所述玉米包括祥249自交系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将玉米的幼胚浸入携带载体Cas9-GFP-gRNA的农杆菌菌液中侵染；

（2）将幼胚移至共培养培养基上培养；

（3）将幼胚移至愈伤诱导培养基上培养，诱导初级愈伤组织；

（4）将初级愈伤组织移至筛选培养基上培养，诱导抗性愈伤组织，再转移到分化培养基上，分化形成再生幼苗；

（5）再生幼苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；

（6）根据sgRNA作用位点的核苷酸序列设计引物，通过PCR法鉴定玉米植株突变位点。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，共培养培养基的组成如下：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO₃ 20μM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT 0.01-1mg/L+乙酰丁香酮200μM+植物凝胶8g/L；

愈伤诱导培养基的组成如下：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO₃ 20μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT 0.01-1mg/L+特美汀200mg/L+植物凝胶8g/L；

筛选培养基的组成如下：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO₃ 20μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+草甘膦200mg/L+植物凝胶8g/L；

分化培养基I：MS+蔗糖20g/L+硫酸铜10μM+MES 0.5g/L+6-BA 3.5mg/L+特美汀200mg/L+草甘膦10mg/L+植物凝胶8g/L；

分化培养基II：MS+蔗糖20g/L+硫酸铜10μM+MES 0.5g/L+特美汀200mg/L+草甘膦10mg/L+植物凝胶8g/L；

生根培养基的组成如下：MS+蔗糖20g/L+MES 0.5g/L+IBA 0.2mg/L+植物凝胶8g/L。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中玉米的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0 mm时，从玉米幼穗上剥取获得。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中将玉米的幼胚浸入如下侵染液中侵染5-15分钟；

侵染液组成为：1/2MS+蔗糖40-80g/L+葡萄糖20-40g/L+L-脯氨酸0.1-0.3g/L+乙酰丁香酮100-300μM+ OD₆₀₀值0.1-0.5携带载体Cas9-GFP-gRNA的农杆菌菌液；

步骤（2）中培养条件为：23℃黑暗培养3-5天；

步骤（3）中培养条件为：26-34℃黑暗培养5-14天。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1）中使用农杆菌菌株为EHA105。