[发明专利]一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用，所述测试系统包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C‑端与报告基因的N‑端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点；在利用CRISPR/Cas9系统编辑(敲除)特定基因之前，靶序列的选择至关重要，这个选择会影响sgRNA对目的DNA的识别效率、与目的DNA的结合效率、Cas9的靶向切割效率和NHEJ修复效率，利用本系统可定量比较不同sgRNA–靶DNA序列的基因编辑效率，可以在短时间内确定工作效果最佳的sgRNA，提高实际敲除的成功率，这不仅可以降低工作成本，还可以提高工作效率，推动工作进程。

(一)技术领域

本发明涉及一种CRISPR/Cas9工作效率测试系统及其应用，可在细胞水平上快速、简便、准确测试由CRISPR/Cas9sgRNA介导的基因编辑效率，筛选可有效用于基因编辑(敲除、突变、敲入)的sgRNA。

(二)背景技术

成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR(Clustered RegularlyInterspersed Short Palindromic Repeats)是目前最高效的基因组编辑系统，是从一种来自细菌及古细菌中降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制改造而来。它包含三个元件：Cas9蛋白、crRNA(CRISPR-associated RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)。含有两个核酸酶结构域(RuvC和HNH)的Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过识别和结合靶DNA的PAM(protospacer adjacent motif)基序(5’-NGG-3’)，解旋靶DNA，通过crRNA中的含20碱基的小向导RNA(sgRNA)与单链靶DNA碱基配对，形成RNA-DNA复合结构，进而利用Cas9RuvC和HNH核酸酶各自切割靶DNA的一条链，形成带有平末端的DNA双链断裂。断裂的DNA要么修复，以保证细胞成活；要么不修复，从而导致细胞死亡。在包括人类细胞的真核细胞中，Cas9诱导的DNA双链断裂主要由细胞内两条保守途径修复：同源重组(homologous recombination；HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining；NHEJ)。NHEJ会产生删除、插入，导致基因变异，甚至失活移码，从而编辑或敲除目的基因。如果能够提供外源同源序列，HR则可以在选定的DNA靶位上、依照基因靶向原理嵌入目的基因或DNA片段。由于PAM基序结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中都能找到大量靶点，利用Cas9诱导的DNA双链断裂及随后的修复，可以通过这些靶点有效敲除目的基因或者嵌入目的基因或基因片段，因此CRISPR/Cas9技术在基因编辑中潜力巨大，在短短的时间内就已得到了广泛的应用。目前，CRISPR/Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，在生物、农业、医学等领域具有巨大的应用潜力和经济效益。