[发明专利]一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述测试系统包括：（1）用于表达sgRNA的质粒；（2）用于表达Cas9的质粒；（3）用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的3'-端与报告基因的5'-端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点，以便插入sgRNA靶向的目标DNA序列；插入目标序列后后随的报告基因因为移码而在细胞中无活性，但当sgRNA引导的CRISPR核酸酶在目标序列对应位点产生DNA双链断裂时，理论上NHEJ修复会有大约三分之一的机会恢复报告基因的正确编码而产生活性，从而可以根据报告基因活性水平快速测试sgRNA介导的在目标靶点的CRISPR工作效率。

2.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述能够编码有效蛋白的核苷酸片段为灭瘟素脱氨酶基因、新霉素抗性基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。

3.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因。

4.如权利要求3所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述报告基因为下列之一：绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP、青色荧光蛋白基因CFP、蓝色荧光蛋白基因BFP、红色荧光蛋白基因RFP、水母发光蛋白基因、克林霉素基因、萤火虫荧光素酶基因FLuc、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。

5.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述限制性核酸内切酶酶切位点为下列之一：I-SceI、EcoRI、KpnI或BamHI。

6.如权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述报告系统是将灭瘟素脱氨酶基因的3'-端与绿色荧光蛋白基因GFP的5'-端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点；所述两个限制性核酸内切酶酶切位点之一为I-SceI。

7.一种权利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统在预测特定sgRNA介导的基因编辑效率中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用方法为：通过分子克隆，在用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统的两个酶切位点之间插入sgRNA靶向的目标DNA序列；然后将表达sgRNA的质粒、表达Cas9的质粒和插入目标DNA序列的报告系统共转染哺乳动物细胞株，转染2-3天后，利用流式细胞仪测量GFP阳性细胞的频率或结合常规双荧光素酶报告基因检测试剂盒，利用酶标仪测量萤火虫荧光素酶基因FLuc和海肾荧光素酶RLuc活性，筛选有效sgRNA，预测所述有效sgRNA在细胞内介导内源基因编辑的效率。

9.一种权利要求1所述用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统在检测和定量突变型非同源末端连接及所产生突变中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用是将用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统编辑的质粒功能框克隆到小鼠基因组ROSA26位点靶向载体pROSA26上形成载体质粒，再利用ROSA26的定点靶向将所述载体质粒中的功能框完整整合到小鼠胚胎干细胞ROSA26位点，建立突变型非同源末端连接报告细胞，利用建立在细胞中的突变型非同源末端连接报告系统，结合常规的细胞学技术和分子生物学技术，检测和定量突变型非同源末端连接及所产生突变；所述报告系统的限制性内切酶之一为限制性核酸内切酶I-SceI。