[发明专利]筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因 的方法及应用。

背景技术

对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvatedioxygenase，HPPD)存 在于各种生物体中，它是一种铁-酪氨酸蛋白，在植物体内可将对羟基丙酮酸(4- Hydroxyphenylpyruvate，HPP)催化为尿黑酸(2,5-dihydroxyphenylacetate，HGA)，进而转 化为光合作用中电子传递所需要的重要物质质体醌和生育酚，其中质体醌还是影响八氢番 茄红素去饱和酶催化的关键辅助因子。鉴于其上述重要作用和特点，HPPD成为继ALS、ACC以 及Protox之后的又一新的除草剂靶标酶。由于该酶抑制剂用于除草方面时具有广谱、高效、 残留低、环境相容性好、使用安全的特点，引起人们对其抑制剂研究的重视，该抑制剂的发 现对环境的保护有重大作用，这也是未来除草剂生产发展的趋势。

抗除草剂农作物的种植，更充分地利用了除草剂的优势。在过去20年里，抗除草剂 作物给农民和环境都带来了巨大利益。目前生产上种植最多的是抗草甘膦玉米和大豆，从 而使草甘膦的施用非常广泛。随着草甘膦的大量使用，抗草甘膦杂草不断出现，从而影响了 抗草甘膦作物的有效性。因此，开发新型抗除草剂作物，如抗HPPD抑制剂类除草剂作物，势 在必行。

本领域已有一些对抗除草剂HPPD基因的研究，但筛选抗除草剂HPPD基因仍然困 难。用植物直接筛选虽然其结果可直接应用，但植物的生长繁殖周期长，传代慢，因此筛选 效率非常低，难以用于实践。抗HPPD抑制剂类除草剂HPPD基因的初步筛选往往是在细菌中 进行。但这些筛选都需要先分离微生物菌株或将HPPD基因克隆在细菌中，再进行单个评估。 这种方法工作量大、范围广、没有针对性，难以进行大规模筛选或从稀有样品中进行筛选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，运用此种方 法筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操 作简便，可在短时间内筛选得到较多的抗HPPD抑制剂类除草剂基因，也容易从稀有样品中 筛选得到抗HPPD抑制剂类除草剂基因。

一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，包括如下步骤：

1)、将含有HPPD抑制剂类除草剂抗性微生物的多种微生物在含有HPPD抑制剂的抗 性筛选培养基中培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；

2)、以所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的HPPD基因的开放阅读框序列， 将扩增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；

3)、对重组菌株的HPPD抑制剂抗性进行验证，获得抗HPPD抑制剂类除草剂基因。

HPPD即对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvatedioxygenase)。

本发明针对现有的抗HPPD抑制剂基因筛选方法中存在的不足，提供了一种快速而 有效地高通量筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，运用此种方法筛选抗HPPD抑制剂类 除草剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，可在短时间内 筛选得到较多的抗HPPD抑制剂类除草剂基因。

优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，在步骤1)中，所述培 养的具体过程为：

将微生物样本于含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养1～10次，，且培养次数 大于1次时，在每相邻两次培养所用抗性筛选培养基中，后一次培养的HPPD抑制剂浓度均不 低于前一次，且后一次培养的菌种来源于前一次培养中存活下来的微生物菌种。

用此方法可筛选到针对不同浓度HPPD抑制剂敏感的菌种，亦即该体系能够快速筛 选出不同程度的抗HPPD抑制剂类除草剂基因。

进一步优选的，在步骤3)中，抗性验证具体包括：

以步骤1)中筛选到的抗性菌种的HPPD抑制剂浓度为最高浓度设置HPPD抑制剂浓 度梯度，将步骤3)中所述重组菌株于HPPD抑制剂含量梯度设置的抗性筛选培养基中培养， 以筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因。