[发明专利]筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法及应用

权利要求书

1.一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、将含有HPPD抑制剂类除草剂抗性微生物的多种微生物在含有HPPD抑制剂的抗性筛 选培养基中培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；

2)、以所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的HPPD基因的开放阅读框序列，将扩 增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；

3)、对重组菌株的HPPD抑制剂抗性进行验证，获得抗HPPD抑制剂类除草剂基因。

2.如权利要求1所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤1) 中，所述培养的具体过程为：

将微生物样本于含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养1～10次，且培养次数大于1 次时，在每相邻两次培养所用抗性筛选培养基中，后一次培养的HPPD抑制剂浓度均不低于 前一次，且后一次培养的菌种来源于前一次培养中存活下来的微生物菌种。

3.如权利要求2所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤3) 中，抗性验证具体包括：

以步骤1)中筛选到的抗性菌种的HPPD抑制剂浓度为最高浓度设置HPPD抑制剂浓度梯 度，将步骤3)中所述重组菌株于HPPD抑制剂含量梯度设置的抗性筛选培养基中培养，以筛 选抗HPPD抑制剂类除草剂基因。

4.如权利要求1～3任一项所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在 于，所述HPPD抑制剂为硝磺草酮或环磺酮。

5.如权利要求4所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于：

在步骤1)中，HPPD抑制剂含量的范围为1～20mM硝磺草酮或0.25～5mM环磺酮，相邻浓 度梯度设置的间距为1.5～5倍。

6.如权利要求1所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，所述抗性 筛选培养基为含有1～20mM硝磺草酮或0.25～5mM环磺酮的SMNT基本培养基；

按体积份数计，所述SMNT基本培养基包括以下组份：

5×M9盐溶液190～210份、245～255mM的MgSO₄溶液4.5～5.0份、97～103mM的CaCl₂溶液 0.8～1.2份、0.128％酪氨酸溶液778～784份、水9～11份；

所述5×M9盐溶液中包括：Na₂HPO₄·7H₂O60～68g/L、KH₂PO₄14～16g/L、NaCl2.4～ 2.6g/L、NH₄Cl4.8～5.2g/L；

所述5×M9盐溶液、MgSO₄溶液、CaCl₂溶液及0.128％酪氨酸溶液所用溶剂均为水。

7.如权利要求1所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤2) 中：

当所述单克隆种属未知时，则扩增所述单克隆的部分16srRNA序列，并将扩增产物测 序以确定所述单克隆种属；

根据得到的种属信息查询所述单克隆的HPPD基因序列并以此为模板设计引物扩增得 到具有HPPD抑制剂抗性的HPPD基因片段并测序；

根据测序结果设计引物，将所述具有HPPD抑制剂抗性的HPPD基因的开放阅读框序列连 入质粒中并于细菌中进行原核表达。

8.如权利要求7所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤2) 中：

所述质粒为pADV3；

所述pADV3的序列由原核表达载体pUC57改造而来，其改造方法为：将pUC57中的MCS序 列替换为SEQIDNO:1所示序列。

9.权利要求1～8任一项所述筛选方法获得的抗HPPD抑制剂类除草剂基因在培育抗 HPPD抑制剂类除草剂植物品种中的应用。

10.权利要求1～8任一项所述筛选方法获得的抗HPPD抑制剂类除草剂基因，其序列为 SEQIDNO:3所示。