[发明专利]松墨天牛谷氨酰胺6‑磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆及用途

说明书

技术领域

本发明属于分子克隆领域，具体涉及一种松墨天牛氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与应用。

背景技术

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine--fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶，参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。葡萄糖进入细胞后先转变为6-磷酸果糖，在GFAT催化下生成6-磷酸葡糖胺，经过中间代谢环节，最终转化为二磷酸尿嘧啶N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)。

松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)，隶属于鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，主要危害马尾松(Pinus massoniana)，油松(P.tabulaeformis)，黑松(P.thunbergii)等生长衰弱或新伐倒的针叶树，是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer))病的主要传播媒介昆虫。目前，GFAT在松墨天牛中尚未有报道，本发明从松墨天牛cDNA文库中克隆了GFAT基因，研究了该基因在松墨天牛各虫态、成虫6个部位、幼虫5个组织中的表达，旨在为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础，为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。

发明内容

本发明从松墨天牛中分离克隆谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因，申请人将该基因命名为MaGFAT。

为了实现以上目的，本发明通过如下技术方案实现：

一种松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶核苷酸序列，其cDNA序列由2624个核苷酸组成，自5′至3′端序列如SEQ IDNO：1所示。

所述的松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因编码氨基酸序列为第1-2058位核苷酸，终止密码子序列是TAG，为第2058-2060位核苷酸。

所述的2058个核苷酸序列编码686个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：2所示。

一种松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因核苷酸序列的克隆方法，其特征在于：包括如下步骤：

松墨天牛总RNA提取、mRNA的反转录、根据本实验构建的松墨天牛cDNA文库，筛选出谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶序列，以此序列为基础，利用Primer premier 5.0软件 设计引物Outer：5′-ATCTCGCTCGTGATGTTCG-3′和Inner：5′-TATGAGGGACCCCGTTTA-3′，并利用3′-Full RACE Core Set with PrimeScript^TM RTase试剂盒中的通用引物3′RACE Outer：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′和3′RACE Inner：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′进行3′RACE。将已知的5′端序列和3′端序列拼接得到完整的谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因核苷酸序列；具体步骤如下：

(1)松墨天牛总RNA提取

松墨天牛幼虫由广东省林科院惠赠，采用人工饲料饲养。分别收集交配期成虫的触角、头(去除触角)、胸、足、翅、腹节等组织样品和幼虫的体壁、脂肪体、血淋巴、中肠、马氏管等组织样品；同时收集松墨天牛的3龄幼虫以及10d蛹及羽化3d的成虫。样品置液氮中迅速冷却后保存于-80℃冰箱备用。

取-80℃保存的松墨天牛样品，置于已用液氮预冷的无RNA酶的研钵，用液氮快速冷冻并研磨成粉末状，按照RNA抽提试剂盒(Omega公司)使用说明，提取松墨天牛各样本的总RNA，并获得约40μl总RNA，-80℃保存。

(2)mRNA的反转录

提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度仪(Nanodrop 2000)检测后，按RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录说明书合成单链cDNA，稀释20倍用作实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的模板。

(3)PCR与RACE