[发明专利]松墨天牛谷氨酰胺6‑磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆及用途

权利要求书

1.松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因序列克隆的方法，依次包括下列步骤：

1)松墨天牛总RNA的提取

取松墨天牛的成虫及幼虫样品来进行部分解剖，获得成虫以及其触角、头部、胸部、腹部、体壁、翅、足等样品和幼虫以及其血淋巴、中肠、脂肪体、马氏管等样品，并将各样品迅速用液氮冷冻后置于-70℃备用。利用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II总RNA提取试剂盒(OMEGA)提取成虫各部位和幼虫各组织的总RNA；

2)引物设计和3′RACE扩增

在本实验构建的cDNA文库中，获得了松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因5′端序列，本发明在此基础上进行3′RACE扩增，以获得墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因全序列；3′RACE扩增的特异性引物为：Outer：5′-ATCTCGCTCGTGATGTTCG-3′和Inner：5′-TATGAGGGACCCCGTTTA-3′：

3)目的基因克隆及测序

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，确定目的片段并回收纯化，与pMD20-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，加入氨苄青霉素来进行抗性蓝白斑筛选，挑选阳性菌落提取质粒，经菌落PCR鉴定后测序；

4)序列拼接

将测序的序列与构建的cDNA文库松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因5′端序列进行拼接，获得松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因全长序列。

4.松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因的分布和表达

1)对松墨天牛各组织、各部位分别提取总RNA，按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser操作手册进行反转录为cDNA模板：将各组织、部位样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR Premix Ex Taq^TM染料法，在罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析；

2)按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒说明书进行PCR反应，实验数据采用相对ΔCT法分析松墨天牛谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺转移酶基因在各样品中的相对表达量；

3)荧光定量PCR所用引物为：Forward(正向)：5′-TTGTGATGAGCGAAGACAGG-3′和Reverse(反向)：5′-CGGCCAACACCTTAACTTTG-3′。