[发明专利]一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法

说明书

本发明涉及一种利用微生物发酵生产10‑脱乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonas osonensis为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在得到的菌体发酵液中投入底物巴卡亭III，进行C10‑脱乙酰基反应转化，生成10‑DAB，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.7562。本发明以巴卡亭III作为底物采用微生物一步C10‑脱乙酰基反应生物合成10‑DAB，具有操作简单、反应专一性好、成本低、反应条件温和、产物易于分离纯化等优点，克服了现有方法步骤繁琐、收率低、副产物多、分离纯化困难、环境不友好等缺点。

技术领域

本发明属于微生物制药及医药工程领域，具体涉及到一种利用Tolumonasosonensis生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法，该方法以Tolumonas osonensis CGMCCNo.7562为菌种，以巴卡亭III为底物，采用微生物C10-脱乙酰基反应转化生产10- 脱乙酰巴卡亭III的方法。

背景技术

10-脱乙酰巴卡亭III(10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物的典型代表--多烯紫杉醇的前体物质。它广泛分布于红豆杉植物的树叶、根、皮、枝干中，在不同种植物的含量差异较大，但总体含量偏低，一般在0.00513％-0.175％左右。其传统制备方法是从植物中进行提取，但此过程工艺步骤冗长、需要经过多次层析、梯度洗脱、多次重结晶后才能获得精制品，不仅造成了10-DAB的大量损失，降低了收率，而且过程中还大量使用乙腈和石油醚等有机溶剂，对环境造成不良影响。

微生物转化是指某一微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，其本质是利用生物体所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应，它具有反应选择性强(位置选择性、立体选择性)、反应条件温和、副产物少和不造成环境污染等优点。Tolumonasosonensis是2011年Matthew等人发现的属于甲苯单胞菌属的一个新种，目前利用该菌株转化巴卡亭III生产10-脱乙酰巴卡亭III的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺简单、副产物少、经济实用、反应条件温和且对环境友好的生产10-DAB的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法，采用Tolumonasosonensis为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在得到的菌体发酵液中投入底物巴卡亭III，进行C10-脱乙酰基反应转化，生成10-DAB，所述的Tolumonas osonensis由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏 ，保藏 编号为CGMCC No.7562。

而且，所述的在制成的菌体发酵液投入巴卡亭III进行C10-脱乙酰基反应的方式是：用有机溶剂将巴卡亭III助溶，配制成的溶液加入到菌体发酵液中，巴卡亭III投入的终浓度为0.04-1g/L，有机溶剂加入的体积比例为2-25％。

而且，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯的其中一种。

而且，所述的C10-脱乙酰基反应的转化条件是：28-37℃、150-300r/min转化培养60-144h。

而且，所述的Tolumonas osonensis的一级种子培养的方式是：将Tolumonasosonensis CGMCC No.7562在斜面上培养，22℃-30℃下恒温培养2-5d后，取一满环至种子培养基中，22℃-30℃、120-280r/min振荡培养18-30h，得到适于接种的种子培养液。

而且，所述的Tolumonas osonensis的二级发酵培养的方式是：将种子培养液以5％-15％的接种量接入发酵培养基，22℃-30℃、120-280r/min振荡培养20-32h进行二级发酵培养，得到菌体发酵液。