[发明专利]一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组蛋白Vo，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：loop1‑(linker a)_n1‑loop2‑(linker b)_n2‑loop3‑(linker b)_n3‑loop4‑(linker a)_n4‑loop1‑(linker a)_n5‑loop2‑(linker b)_n6‑loop3‑(linker b)_n7‑loop4。本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。本发明的重组蛋白Vo可用于诊断试剂、预防或治疗性药物的制备，具有良好的抗E.coli K1感染的免疫保护效果。

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种重组脑膜炎大肠杆菌K1疫苗蛋白Vo，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

细菌性脑膜炎是新生儿的常见感染性疾病，是新生儿死亡及远期致残的主要原因。世界卫生组织数据显示，新生儿细菌性脑膜炎发生率位于新生儿感染性疾病的前5位，其死亡率高达40％。由于早产儿的增多及其它原因，我国新生儿细菌性脑膜炎发病率逐渐上升，其已成为新生儿住院三大病因之一。随着抗生素耐药性的泛滥，新生儿细菌性脑膜炎的疗效和预后更加不容乐观。资料显示约有1％-40％的新生儿细菌性脑膜炎患者死亡，仅30％的患者能够治愈。患者治愈后通常出现神经系统后遗症，如脑积水、癫痫、智能低下等，为家庭和社会造成严重的负担。

大肠杆菌K1(E.coli K1)是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体，约超过80％病例的由该菌感染所致。外膜蛋白A(outer membrane A，OmpA)是E.coli K1的关键致病因子，在E.coli K1引发的新生儿脑膜炎中发挥重要作用(Kim K.S.2008.Nat Rev Microbiol6：625-634.)。研究发现，E.coli K1引起新生儿脑膜炎必须通过以下4个病理过程：①E.coli K1感染宿主并定植新生儿肠道或泌尿道；②E.coli K1从感染定植部位入血并在血液中繁殖，引起新生儿菌血症；③E.coli K1突破新生儿血脑屏障，进入中枢神经系统；④E.coli K1在颅内释放促炎因子和毒素，引起白细胞的浸润和血脑屏障通透性增加，最终引发新生儿脑膜炎等感染性疾病。在整个新生儿脑膜炎的发病过程中，E.coli K1能抵抗血液免疫系统的杀伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染是决定细菌感染的关键因素，而外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)在此细菌致病的关键过程中都发挥决定性的作用(Krishnan S.，and N.V.Prasadarao.2012.FEBS J.)，所以OmpA可以作为脑膜炎大肠杆菌疫苗的重要候选疫苗分子。

OmpA为I型跨膜蛋白，其全长346个氨基酸，主要由2个domain组成，N端1-198氨基酸为典型的beta-barrel的跨膜结构，C端domain为肽聚糖结合结构域。重组表达的全长OmpA蛋白因为含有跨膜结构难溶于水，不能作为疫苗分子。OmpA的N端结构域是其主要功能结构域，其暴露在胞外的loop1，loop2，loop3，loop4是其介导OmpA相关病理生理过程的关键结构域。此外，通过AntiJen，Bepipred和Epitome等表位软件预测发现OmpA的loop1，loop2，loop3，loop4具有很多的B细胞表位和T细胞表位。目前尚没有基于OmpA蛋白制备抗体的报道。

发明内容

针对脑膜炎大肠杆菌的严重危害，本发明提供一种脑膜炎大肠杆菌K1的重组蛋白Vo，该重组蛋白由脑膜炎大肠杆菌K1OmpA的有效成分构成，其可应用于制备脑膜炎大肠杆菌的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种重组蛋白Vo，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：