[发明专利]堇叶紫金牛快速工厂化生产方法

说明书

一、技术领域

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及堇叶紫金牛快速工厂化生产方法

二、研究背景

堇叶紫金牛(Ardisia Violacea)，又名裹堇紫金牛，属紫金牛科紫金牛属，是一种特产于浙江和台湾的珍稀濒危植物。堇叶紫金牛茎皮灰褐色，被微柔毛，叶片略呈莲座状，叶片基部钝圆或微心形，上面微带红色，下面带淡紫色，边缘呈不规则波状浅圆齿，伞形花序单生于叶腋或茎的上部，花冠白色，花期6-7月，植株姿态幽雅，红果艳丽经久，圆滑晶莹，清秀、典雅，红果配紫叶，令人赏心悦目，并且具有较强的耐荫性和耐旱性，可作为庭院地被、林下地被和观叶观果小盆栽类产品，具有极高的市场开发价值。由于堇叶紫金牛为野生资源，且资源量极为有限，常规的繁育方式，无法在最大化保护野生资源的基础上进行工厂化生产，而组培快繁技术体系的建立则能够以较少的野生资源为材料，短时间内来进行大规模的工厂化生产，能够实现该濒危植物的资源保护和种苗繁育，并推动该物种市场化的进程。

三、发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种堇叶紫金牛的快速工厂化生产方法，提高了生产效率和成活率，降低了生产成本，并且获得的再生苗能够稳定的延续野生资源的优良性状。

为此，本发明采取如下的技术方案：

1)将无病虫害的堇叶紫金牛性状优良的单株于3月份开始恢复生长时，将其放到温室内养护，每隔一周叶面喷洒一次0.3％-0.5％的多菌灵溶液，直至5月份左右。待新芽抽出后，剪取其中半木质化的嫩茎，将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，先用0.5％的新洁尔灭+洗洁精混合溶液搅拌消毒处理1h，倒掉消毒液，在流水下冲洗1h，备用。超净工作台中，处理过备用的小段用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，用70％-75％的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1％的升汞溶液消毒5-10min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次，备用。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率；将以上消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有1个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上。培养条件为：温度25±2℃，光照时间为10h/d，光照强度为1500-2000Lx，湿度为60％-65％。启动培养基为：MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10-0.20mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH为5.8-6.0；

2)启动培养20d以后，休眠的腋芽萌发，将新萌发的嫩芽切下来，接种到不定芽分化(增殖)培养基上。不定芽分化培养基为：MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10-0.20mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH为5.8-6.0；

3)增殖培养40d以后，腋芽分化产生大量不定芽，不定芽以芽丛的形式存在。将得到的不定芽丛，轻轻拨散成单个不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上。壮苗生根培养条件为：温度25±2℃，光照时间为8h/d，光照强度为1000Lx，湿度为60％-65％。所述的壮苗生根培养基为：MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

4)壮苗生根培养20d以后，不定芽逐渐分化为健壮的再生小苗，同时基部产生少量愈伤组织，愈伤组织上部分化出少量不定根。培养40-50d以后，再生小苗的平均株高为4.68cm，平均单株小苗的根系条数为4.28。将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，自然环境下炼苗10d。移栽前3-4d，将组培瓶的瓶盖松动，但不要完全打开，移栽前1-2d，将组培瓶的瓶盖完全打开，并往组培瓶内灌入少量的无菌水，生根组培苗移栽前，先用镊子将生根苗轻轻地从培养基内夹出来，将根部所带的培养基用清水完全清洗干净，将清洗好的生根苗以3-4株为一丛种入炼苗基质(松鳞，移栽前1周左右，用0.8％高锰酸钾溶液消毒处理)中。最后，用0.3％多菌灵溶液对移栽的生根苗和基质表面进行均匀喷施，以松鳞完全浸湿为宜，然后用塑料薄膜做成封闭的小拱棚，进行保温保湿40d左右。待生根小苗长出新的须状根并恢复健壮生长后，将小拱棚的两端打开，缓慢放风，约1周后，将小拱棚完全打开，使其在自然条件下生长。