[发明专利]CAPRI细胞及其制备方法

说明书

本发明提供一种级联式细胞因子诱导激活的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞(CAPRI细胞)及其制备方法，CAPRI细胞的制备包括外周血单核细胞体外激活以及CAPRI细胞扩增的步骤。本发明通过体外抗淋巴细胞分化抗原抗体及细胞因子组合刺激，经两步活化获得大量能够识别肿瘤特异性抗原的T淋巴细胞。经激活和诱导的肿瘤特异性细胞可在患者体内对肿瘤细胞进行杀伤，从而达到配合放化疗或单独抑制原发肿瘤生长的作用；通过杀伤微小转移肿瘤灶、清除循环转移肿瘤或肿瘤干细胞，从而达到延缓复发和转移，延长患者生存期，提高患者生存质量的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及CAPRI细胞及其制备方法。

背景技术

肿瘤的生物治疗现已被广泛作为除手术、放疗及化疗之外的第四种疗法。目前比较常见的疗法有树突状细胞(DC)疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法等。

DC疗法的方案是从患者的外周血淋巴细胞中分离出DC细胞前体即单核细胞，经IL-4、GMCSF及TNF等细胞因子激活，获得有抗原呈递功能的DC，在DC成熟的过程中可加入患者肿瘤溶解物或合成肿瘤多肽或肿瘤细胞系溶解物或肿瘤抗原mRNA等肿瘤信息分子，终产品DC为携带肿瘤信息的抗原呈递细胞。在临床应用时，可将DC作为疫苗接种给患者，诱导患者的免疫防御，从而达到在体内活化激活肿瘤特异性杀伤细胞的作用。

CIK疗法的方案是从患者外周血PBMC中分离出以T细胞为主的淋巴细胞，通过液相中的小鼠抗人CD3抗体激活T淋巴细胞，并使用IL-2等能够维持T细胞高速大量增殖的细胞因子获得大量以CD56+/CD3+表型的NKT细胞，通常以50ml外周血中的淋巴细胞作为起始，经过14-20天的培养，获得十亿以上的细胞，这些细胞通过静脉回输给肿瘤患者，以提高肿瘤患者免疫功能，通过以非特异性杀伤为主的杀伤作用抑制肿瘤及微小转移。现在也有将DC技术结合CIK技术的报道，方案为在DC培养成熟后(7-10天)加入单独培养的CIK细胞再次培养(7-10天)，培养后的DC及CIK混合物再回输患者。

然而，肿瘤的以下特性会为肿瘤的细胞治疗方案造成困难：1、 肿瘤的多样性造成各瘤种的特异性抗原不同，从而对依赖于特异性抗原的细胞培养方法造成影响。2、肿瘤在其形成、生长及转移的过程中，细胞表面所表达的肿瘤抗原会产生突变。3、肿瘤本身具有异质性。4、肿瘤在体内能够分泌诸如IL-6、IL-4、IL-10等能够诱导免疫抑制或Th2、Th17等不利于细胞免疫的细胞因子，造成肿瘤杀伤免疫应答的不足。

以上几个肿瘤特性均对DC疗法的方案造成了不利的影响，首先，由于肿瘤的多样性及肿瘤抗原的突变造成DC疗法中选取普适的肿瘤抗原成为不可能完成的任务，其次，随着肿瘤恶性程度的发展及从原发肿瘤到转移肿瘤的病情发展过程，肿瘤的抗原在不断改变，使得在DC制备过程中加入的原发肿瘤抗原、细胞系抗原、合成多肽等失去其作用，因为载有以上抗原的DC诱导的杀伤细胞的攻击对象在患者体内不复存在，而大量不表达以上抗原的变异转移肿瘤细胞又不能被识别杀伤。此外，DC方案依赖于患者本身的免疫应答，而患者往往由于肿瘤所分泌的细胞因子及肿瘤术后的放化疗，处于免疫抑制状态。DC在进入患者体内后，往往不能有效诱导免疫应答。

对于非特异性杀伤的治疗方案，例如CIK疗法，其不足在于，以NK及NKT为主的杀伤会受到自体MHC-C分子的抑制。在自体系统内，NK及NKT细胞不能杀伤表达MHC分子的肿瘤细胞，大量的临床试验表明，超过80％的肿瘤细胞表面表达MHC分子，少量晚期肿瘤细胞由于染色体丢失、甲基化或其他分子生物学改变才会有MHC-C分子不表达的情况，在对60例自体肿瘤的CIK细胞杀伤试验中，发现平均杀伤率为7.35±1.66％，仅2例杀伤率超过30％。而在MHC不配型的异体系统的杀伤率则可高达85％。因此在CIK疗法中MHC-C对非特异性杀伤的抑制作用是其主要缺陷。此外在CIK疗法中细胞是从新鲜培养物中获取直接回输患者，造成制备安全性及临床配合度方面的困扰。而且，传统疗法均需长期(一般超过14天)的细胞培养，不仅增 加了工作量，设备占用率高，提高了细胞培养成本，而且细胞培养物的污染几率倍增。

发明内容