[发明专利]CAPRI细胞及其制备方法

权利要求书

1.CAPRI细胞的制备方法，其特征在于，包括外周血单核细胞体外激活以及CAPRI细胞扩增的步骤；

所述外周血单核细胞体外激活是将外周血单核细胞用OKT3抗体进行初级刺激3小时后，在存在激活培养基I的情况下进行体外激活培养3小时；所述激活培养基I中含rhIL-210-2000IU/ml、rhIFN-γ10-2000IU/ml、rhIL-4 10-800IU/ml、rhGM-CSF 200-400IU/ml、rhTNF-α200-500IU/ml及PGE-2 1-5μg/ml，以水配制；

所述CAPRI细胞扩增是将未经上述体外激活处理的外周血单核细胞与经过上述体外激活处理的外周血单核细胞混合孵育，在存在激活培养基Π的情况下进行CAPRI细胞扩增培养72小时；所述激活培养基Π中含rhIL-2 10-2000IU/ml、rhIFN-γ100-2000IU/ml、rhIL-710-200IU/ml及IL-15 10-300IU/ml，以水配制。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CAPRI细胞由自体同源的或同种异体的细胞构成。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，未经体外激活处理的外周血单核细胞与经过体外激活处理的外周血单核细胞按1:10-10:1的比例混合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，未经体外激活处理的外周血单核细胞与经过体外激活处理的外周血单核细胞按1:1的比例混合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行初级刺激之前，先从患者外周血中分离、纯化单核细胞，具体方法为：抽取患者外周血，加肝素抗凝处理，然后分装至离心管中1500g离心20分钟，弃上清，向离心管中加入RPMI 1640培养基100-200ml，制成淋巴细胞悬液，然后加入到预置有淋巴细胞分离液的离心管中，离心后将淋巴细胞层转移至另一离心管中，加RPMI 1640培养基重悬，750g离心5-12分钟，弃上清，重复以上重悬、离心操作1次，向获得的单核细胞中加完全培养液，制成淋巴细胞悬液；或者，采用白细胞分离技术从患者外周血中获得单核细胞，向获得的单核细胞中加完全培养液，制成淋巴细胞悬液；

所述完全培养液的制备方法为:全血于1500g离心20分钟，弃上清，4℃静置过夜，再于1500g离心15分钟，取上清作为培养基中添加的血浆；向RPMI 1640培养基中加入血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v％自身血浆的完全培养液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外周血单核细胞体外激活的具体方法为：

1)细胞培养瓶处理：用PH8.6的PBS缓冲液配制浓度为0.2-2μg/ml的OKT3抗体包被液，向75cm²细胞培养瓶中加入12ml包被液，4℃过夜处理，使用前去掉包被液，用生理盐水洗1-2次，然后每瓶加入18ml完全培养液；

2)体外激活：向上述培养瓶中加入含3×10⁷-6×10⁷个单核细胞的淋巴细胞悬液12ml，于38℃，6％CO₂培养箱中培养3小时，进行初级刺激；3小时后加入激活培养基I 0.5ml，继续培养3小时，获得体外激活的外周血单核细胞；

所述激活培养基I中含rhIL-2 10-2000IU/ml、rhIFN-γ10-2000IU/ml、rhIL-4 10-800IU/ml、rhGM-CSF 200-400IU/ml、rhTNF-α200-500IU/ml及PGE-2 1-5μg/ml，以水配制。