[发明专利]一种鉴定阿胶原料中驴源性成分的特异引物对及其方法

说明书

本发明公开了一种准确鉴别阿胶原料驴源性成分的特异性引物对及其方法。所述引物对包括引物PF和引物PR，所述引物PF的序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物PR的序列如SEQ ID NO.2所示。使用此方法能准确鉴别阿胶原料驴源性成分，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、酶切、电泳检测即可完成对样品的鉴别，具有操作简单、特异性强、重复性好等优点，可用于阿胶原料驴源性成分的快速鉴定。

技术领域

本发明涉及名贵中药阿胶原料的品质鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定阿胶原料驴源性成分的特异引物对及其方法。

背景技术

阿胶为《中国药典》2015版的收录品种，为马科动物驴Equus asinm L.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，被列为“上品”，称其“可久服轻身益气”，是药食同源的重要物种，尤其在治未病方面功效显著。关于阿胶的医方医案有3200多个，其中包括200多个膏方和200多个食疗方。现代研究表明阿胶能调节身体机能，增强免疫力，在肿瘤辅助治疗、血液病等重大疾病防治上，其治疗优势也正逐步凸显。仅《中国药典》2015版收载的含阿胶的成药即多达34个。我国驴养殖业发展严重滞后，驴的存栏数呈逐年下滑之势。以致近年制胶原料驴皮短缺、原料价格上涨，造成目前阿胶市场混乱，掺杂使假情况屡屡发生，主要掺假成分包括猪皮、牛皮胶、马皮胶甚至皮革下脚料等，给大众用药安全带来重大隐患。传统的阿胶真伪鉴别方法，采用外观性状和理化性质等方法，需要极为丰富的个人经验和深厚的专业知识，而各种杂皮胶的制备工艺与正品相似，故其外观性状极为相近，更大大增加了鉴别的难度。近来有采用近红外光谱技术对阿胶真品和伪品进行快速区分的报道，但由于正品和伪品之间缺乏特征性指标，易对未知样品造成误判。故把好原料关对于阿胶及其制品的质量控制相当关键。驴Equus.asinus L.和马Equus.caballus orientalis Noack为同科同属动物，骡子为马和驴的杂交种。驴皮与马皮、骡皮在毛色、性状等方面十分相近，肉眼很难区分，故市场上以马皮等作为驴皮伪品制造阿胶较为常见。

因此，寻找一种简单、快速且准确可靠的鉴定阿胶原料驴源性成分的方法显得尤为迫切。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定阿胶原料驴源性成分的特异引物对及其方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述鉴定阿胶原料驴源性、马源性成分的共用特异性引物对包括引物PF和引物PR：

引物PF的序列为5'-TTTGCCTTCCACTTTATTCTA-3'(SEQ ID NO.1)；

引物PR的序列为5'-GTGTAGGGTAGGGATGAGTG-3'(SEQ ID NO.2)。

所述鉴定阿胶原料驴源性成分的方法包括如下步骤：

(1)按常规动物组织基因组DNA提取法提取待测皮张的DNA；用上述的引物对对待测阿胶原料皮张的DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

(2)阿胶原料驴源性成分鉴别：向PCR扩增产物中加入限制性内切酶BamH I进行酶切，限制性内切酶BamH I的酶切位点为5'…G^GATCC…3'；将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，若在50—350bp出现两个片段(约76bp和314bp)，则供试品为驴源性，若不出现上述两个片段，则供试品不为驴源性。

步骤(1)中所述扩增体系及条件如下：

聚合酶链式反应以25μL为参考，各种物品的用量分别为：

PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸10min。