[发明专利]一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法及表达载体

说明书

技术领域

本发明提供了一种基因的原核表达方法以及表达载体，具体涉及一种水稻广谱抗性 负调控基因OsSSI2，属于基因工程技术领域。

背景技术

水稻稻瘟病是由真菌Magnaportheoryzae引起的水稻病害，已是全球最具影响力和 破坏力的水稻病害之一。目前，稻瘟病的防治主要采用化学防治和抗病新品种培育两种 途径。化学防治通常成本高、效果差而且污染环境。因此发掘水稻自身的广谱抗性基因 资源，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施，但对于水稻的广谱抗性机理 不甚清楚。

植物在抗病过程中通过激活不同的防御通路来对抗病原体感染，其中水杨酸(SA)， 茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等植物激素是诱导植物抗病反应的重要的信号分子。每种激素调 节不同的防御通路但相互配合。除了植物激素，一些研究也表明脂肪酸(FA)及其衍生物 在植物抗病反应中也起着重要的作用，扮演了一个重要的信号分子的作用。已经有报道 证明抑制硬脂酰-ACP去饱和酶基因(SACPD)的表达提高了拟南芥(SSI2)和大豆对多种病 原体的抗性。

OsSSI2基因是脂肪酸去饱和基因SSI2在水稻中的同源基因，OsSSI2的RNAi转基 因水稻表现对稻瘟病及白叶枯的广谱抗病性，说明OsSSI2基因参与并且负调控水稻的 抗病反应。因此该基因是研究广谱抗性机理的一个很好材料。

然而，在原核细胞表达外源基因OsSSI2的过程中，尤其是以大肠杆菌为宿主菌高 效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包涵体。以包涵体形式存在的 蛋白质分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，需要通过复性操作 以得到具有预期生物活性的蛋白质。而通常的包涵体复性过程中，复性条件难以控制， 成本高，在复性过程中也很难保证包涵体蛋白形成正确的折叠结构，为后续的研究提供 了诸多的不便。

发明内容

本发明提供了一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法，解决了背景 技术中的不足，该方法能从上清中表达出大量可溶性的OsSSI2蛋白，最终提高了目的 蛋白的可溶性表达。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法，包括以下步骤：

(1)、pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体的构建：

以OsSSI2质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶BamHI、EcoRI为酶切位点 设计引物，引物为：

OsSSI26P-1-BamHIF：5’—GATAGGATCCGCGTCGAGGATGGCGCTCC—3’；

OsSSI26P-1-EcoRIR：5’—GCGAGAATTCGAGTTGAACTTCCCTACC—3’；

利用PCR反应扩增出目的片段，扩增反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测；再使 用清洁回收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶BamHI和EcoRI同 时双酶切目的片段和pGEX-6P1空载体；使用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段及载 体片段进行切胶回收，用Ligationhigh连接酶连接OsSSI2目的片段和pGEX-6P1载体 片段，然后转化DH5α感受态细胞，涂Amp⁺平板后于恒温培养箱内倒置过夜培养；

从平板上随机挑取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳 性的单克隆进行测序，其测序结果100％匹配，说明pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体构 建成功；

(2)、重组蛋白的诱导表达：

将构建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重组质粒和pGEX-6P1载体转化BL21表达菌株， 涂Amp⁺平板后于恒温培养箱内倒置过夜，挑取单克隆菌落接种于含Amp⁺的液体LB 培养基中，于摇床中振荡培养作为种子液，将种子液接种至含Amp⁺的液体LB培养基 中，继续用摇床振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，保存菌液后加入IPTG，振荡培养诱导蛋 白的表达。

步骤(1)中所述PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退 火30s，68℃延伸2.0min，重复34个循环，68℃延伸10min。