[发明专利]一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法及表达载体在审
申请号: | 201610060819.6 | 申请日: | 2016-01-28 |
公开(公告)号: | CN105543264A | 公开(公告)日: | 2016-05-04 |
发明(设计)人: | 刘新琼;陈亚红;刘早利;王春台 | 申请(专利权)人: | 中南民族大学 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70 |
代理公司: | 武汉华旭知识产权事务所 42214 | 代理人: | 刘天钰 |
地址: | 430074 湖北*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 水稻 广谱 抗性 调控 基因 osssi2 表达 方法 载体 | ||
1.一种水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法,其特征在于包括以下步 骤:
(1)、pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体的构建:
以OsSSI2质粒DNA为PCR扩增模板,限制性内切酶BamHI、EcoRI为酶切位点 设计引物,引物为:
OsSSI26P-1-BamHIF:5’—GATAGGATCCGCGTCGAGGATGGCGCTCC—3’;
OsSSI26P-1-EcoRIR:5’—GCGAGAATTCGAGTTGAACTTCCCTACC—3’;
利用PCR反应扩增出目的片段,扩增反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测;再使 用清洁回收试剂盒对目的片段进行清洁回收,然后用限制性内切酶BamHI和EcoRI同 时双酶切目的片段和pGEX-6P1空载体;使用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段及载 体片段进行切胶回收,用Ligationhigh连接酶连接OsSSI2目的片段和pGEX-6P1载体 片段,然后转化DH5α感受态细胞,涂Amp+平板后于恒温培养箱内倒置过夜培养;
从平板上随机挑取单克隆,提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定,鉴定结果为阳 性的单克隆进行测序,其测序结果100%匹配,说明pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体构 建成功;
(2)、重组蛋白的诱导表达:
将构建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重组质粒和pGEX-6P1载体转化BL21表达菌株, 涂Amp+平板后于恒温培养箱内倒置过夜,挑取单克隆菌落接种于含Amp+的液体LB 培养基中,于摇床中振荡培养作为种子液,将种子液接种至含Amp+的液体LB培养基 中,继续用摇床振荡培养至OD600为0.5~0.7,保存菌液后加入IPTG,振荡培养诱导 蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法,其特 征在于:步骤(1)中所述PCR反应程序为:94℃预变性2min;94℃变性15s, 60℃退火30s,68℃延伸2.0min,重复34个循环,68℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的原核表达方法,其特 征在于:步骤(2)中加入IPTG的终浓度为0.3mmol/L,于27℃振荡培养7h诱导蛋 白的表达。
4.权利要求1中所述的pGEX-6P1-OsSSI2原核表达载体,所述表达载体中包含有 水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2。
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