[发明专利]一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法

说明书

本发明公开了一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法。EMSA探针所述包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列。所述EMSA探针的制备方法，包含以下步骤：合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核苷酸序列与接头序列的核苷酸序列相同；采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。使用所述的EMSA探针可进行EMSA。本发明由单链探针经PCR制得双链探针，不会出现由于复性不彻底造成的假阴性，还克服了单链自由探针带来的显影误差。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法。

背景技术

凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是研究启动子结合蛋白的经典方法，是一种用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技术。EMSA基本过程是将³²P或³³P标记或非放射性标记的包含特异的DNA位点的DNA片段与DNA结合蛋白共同孵育后进行电泳分析，蛋白-DNA复合物通过EMSA与游离DNA分离开来，蛋白质阻碍与其所结合的DNA片段的移动性。因此，游离DNA比DNA-蛋白质复合物移动的更快，凝胶的图像可以揭示游离和结合的标记的DNA的位置。EMSA不仅简单、迅速、灵敏度高；且可以用竞争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。目前，EMSA可以用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质，EMSA还可以结合蛋白双向电泳及质谱技术进行未知蛋白的鉴定分析。

随着EMSA技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。Jiang X等用EMSA方法证明了AP1能够结合在启动子的功能区域，并且调控LoVo细胞的PPARdelta的表达(Jiang,X.,et al.,Transcription factor AP1 binds the functionalregion of the promoter and regulates gene expression of human PPARdelta inLoVo cell.Tumour Biol,2013.6(34):p.3619-3625)。Katanin是参与微管切断ATP酶家族成员的蛋白质，它的两种异源二聚体结构由KATNA1和KATB1编码，而Elk1能够与微管相互作用，Selcuk E等用EMSA方法证明Elk1能够结合KATB1启动子，调控其表达(Selcuk,E.,D.Canbaz and A.Et,Katanin-p80gene promoter characterization and regulationvia Elk1.PLoS One,2013.7(8):p.e69423)。凝胶阻滞电泳分析显示青蒿素激活PXR与CYP3A4 DNA 结合的能力，表明CYP3A4的诱导是由青蒿素通过PXR的活化所介导(Hu,D.,etal.,Artemisinin protects against dextran sulfate-sodium-induced inflammatorybowel disease,which is associated with activation of the pregnane Xreceptor.Eur J Pharmacol,2014(738C):p.273-284)。