[发明专利]对橙色粘球菌JCH-04次级代谢产物分离纯化提取抗霉枯草菌素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及橙色粘球菌JCH-04，具体涉及一种对橙色粘球菌JCH-04次级代谢产物 分离纯化提取抗霉枯草菌素的方法。

背景技术

抗菌脂肽具有区别于常规抗生素的全新抗菌机制，不仅不易产生耐药性，而且对 传统药物已具有耐药性的菌株仍然有良好的杀菌和抑菌功效；同时，其抗菌谱之广、抗菌效 果佳、不残留，对G^—、G⁺菌、真菌和支原体等均具有良好的抑制和杀灭作用，随着达托霉素、 棘白霉素等新一代脂肽类抗生素的上市，越来越多的科研工作者将目光转移至对该类抗菌 物质的研发上，使其成为绿色安全、新型高效的抗菌药物的研发方向。

抗菌脂肽常见于解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的次级代谢产物中，而粘细菌 作为天然活性物质的生产者，是一类重要的药源菌，可产生异常丰富的次级代谢产物，包括 芳香族，杂环类，醌类，大环类，聚醚类，多烯类，肽类化合物等，却未见报道其可产抗菌脂肽 类物质。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种对橙色粘球菌JCH-04次级代谢产物分离纯化提取抗 霉枯草菌素的方法，对橙色粘球菌JCH-04进行发酵培养，由其次级代谢产物分离纯化提取 抗霉枯草菌素（Mycosubtilin），它是抗菌脂肽的一种，扩大抗菌脂肽的提取途径。

本发明的技术解决方案是：对橙色粘球菌JCH-04的次级代谢产物进行分离纯化提 取抗霉枯草菌素（Mycosubtilin），该橙色粘球菌JCH-04（MyxococcusfulvusJCH-04）在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阴区大屯路中国科学 院微生物研究所，保藏日期2009年1月22日，保藏编号为：CGMCCNo.2893；取一环菌种接种于 装有25mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃180rpm培养2天得种子液；将种子液以体积比1: 10接种于含有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃180rpm培养6天，得发酵液；将 1000mL发酵液用60目筛过滤，收集树脂，装入层析柱中，用质量浓度20%甲醇冲洗，再用纯甲 醇洗脱，收集洗脱液，50℃旋转蒸发，浓缩得粗提物；粗提物1.9631g中分别加入50mL的水和 乙酸乙酯，混匀后离心，吸取水相，冷冻干燥得冻干粉；冻干粉563.5mg用3mL纯甲醇溶解，离 心，取上清液，通过SephadexLH-20凝胶层析分离，收集140~180min的馏分；将馏分于50℃ 旋蒸浓缩至2mL，通过半制备色谱分离，收集保留时间为39.159min和42.919min的组分， 分别为C14Mycosubtilin和C15Mycosubtilin。

其中，对橙色粘球菌JCH-04的次级代谢产物进行分离纯化提取抗霉枯草菌素 （Mycosubtilin）的具体步骤是：

（1）种子液培养：取上一环保藏编号为CGMCCNo.2893的橙色粘球菌JCH-04的菌种接种 于装有25mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃180rpm培养2天，得种子液；其中，使用的液体 种子培养基配方g/L计为：土豆淀粉5.0～15，葡萄糖2～5，酵母粉0.5～10，脱脂奶粉 2.0～10，CaCl₂0.5～2.0，MgSO₄·7H₂O0.5～2.0，Fe³⁺-Na-EDTA0.005～0.02，去离子水定 容至1000mL，pH7.2；

（2）发酵培养：将上述种子液以体积比1:10接种于含有100mL发酵培养基的500mL三角 瓶中，30℃180rpm培养6天，得发酵液；其中，使用的液体发酵培养基配方g/L计为：土豆淀 粉5.0～15，葡萄糖2～5，酵母粉0.5～10，脱脂奶粉2.0～10，CaCl₂0.5～2.0，MgSO₄· 7H₂O0.5～2.0，Fe³⁺-Na-EDTA0.005～0.02，甘油5.0～15，XAD-16大孔吸附树脂15～ 30，去离子水定容至1000mL，pH7.2；