[发明专利]对橙色粘球菌JCH-04次级代谢产物分离纯化提取抗霉枯草菌素的方法

权利要求书

1.对橙色粘球菌JCH-04的次级代谢产物进行分离纯化提取抗霉枯草菌素的方法，该橙 色粘球菌JCH-04（MyxococcusfulvusJCH-04）在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.2893；其特征是：取一环菌种接种于装有25mL种子培 养基的250mL摇瓶中，30℃180rpm培养2天得种子液；将种子液以体积比1:10接种于含有 100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃180rpm培养6天，得发酵液；将1000mL发酵液用60 目筛过滤，收集树脂，装入层析柱中，用质量浓度20%甲醇冲洗，再用纯甲醇洗脱，收集洗脱 液，50℃旋转蒸发，浓缩得粗提物1.9631g；粗提物中分别加入50mL的水和乙酸乙酯，混匀后 离心，吸取水相，冷冻干燥得冻干粉563.5mg；冻干粉用3mL纯甲醇溶解，离心，取上清液通过 SephadexLH-20凝胶层析分离，流速0.6mL/min，收集140~180min的馏分；将馏分于50℃旋 蒸浓缩至2mL，通过半制备色谱分离，收集保留时间为39.159min和42.919min的组分，分 别为C14Mycosubtilin和C15Mycosubtilin。

2.根据权利要求1所述的对橙色粘球菌JCH-04的次级代谢产物进行分离纯化提取抗霉 枯草菌素的方法，其特征是该方法具体步骤是：

（1）种子液培养：取上一环保藏编号为CGMCCNo.2893的橙色粘球菌JCH-04的菌种接种 于装有种子培养基的摇瓶中，30℃180rpm培养2天，得种子液；其中，1000mL种子培养基配 方为：10g土豆淀粉，2g葡萄糖，2g安琪酵母，4g脱脂奶粉，1g氯化钙，1g硫酸镁，8mg乙二胺四 乙酸铁钠盐，用去离子水定容至1000mL，pH为7.2；

（2）发酵培养：将上述种子液以体积比1:10接种于含有100mL发酵培养基的500mL三角 瓶中，30℃180rpm培养6天，得发酵液；其中1000mL发酵培养基配方为：10g土豆淀粉，2g葡 萄糖，2g安琪酵母，4g脱脂奶粉，1g氯化钙，1g硫酸镁，8mg乙二胺四乙酸铁钠盐，5g甘油，20g XAD-16大孔吸附树脂，用去离子水定容至1000mL，pH为7.2；

（3）提取粗产物：将上述1000mL发酵液用60目筛过滤，收集树脂，先用水洗去树脂表面 残留的发酵液，然后将树脂装入玻璃层析柱中，层析柱规格2×50cm，用100mL质量浓度20% 甲醇以1mL/min的流速流过树脂柱清洗树脂，再用纯甲醇以1mL/min的流速洗脱树脂，收集 甲醇洗脱液200mL，将200mL甲醇洗脱液于50℃旋转蒸发，浓缩得油脂状粗提物，称重 1.9631g；

（4）萃取：粗提物1.9631g中分别加入50mL乙酸乙酯和50mL水，溶解粗提物，10000rpm离 心3min，乙酸乙酯相和水相分层，用移液器吸取水相，将水相冷冻干燥得冻干粉，称重 563.5mg；

（5）SephadexLH-20凝胶层析：用3mL纯甲醇溶解冻干粉563.5mg，离心取上清液，通过 SephadexLH-20凝胶层析分离，凝胶层析柱规格为2×50cm，SephadexLH-20凝胶量为20g， 洗脱剂为纯甲醇，流速0.6mL/min，收集140~180min的馏分；

（6）半制备色谱分离：将上述馏分于50℃旋转蒸发浓缩至2mL，再采用半制备色谱分离 纯化，制备柱为C18柱（HederaODS-2，5μm，10.0×250mm），检测波长215nm，进样量2mL，收 集保留时间为39.159min和42.919min的组分，于50℃旋转蒸发除去乙腈后，冷冻干燥，分 别得C14Mycosubtilin31.4mg和C15Mycosubtilin28.6mg。

3.根据权利要求2所述的对橙色粘球菌JCH-04的次级代谢产物进行分离纯化提取抗霉 枯草菌素的方法，其特征是：C14Mycosubtilin的分子式为C₄₈H₇₄O₁₄N₁₂,C15 Mycosubtilin的分子式为C₄₉H₇₆O₁₄N₁₂;C14Mycosubtilin分子结构式为：

，

C15Mycosubtilin为其同系物，在脂肪酸直碳链上多一个亚甲基(-CH₂)。