[发明专利]脂肪干细胞的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于一种药物制备以及用途领域，具体涉及自体脂肪干细胞的制备以及治疗II型 糖尿病用途。

背景技术

目前临床上II型糖尿病的治疗，目的是降低血糖，控制并发症。采取的措施是口服降糖 药、注射胰岛素、控制饮食、适当运动。然而上述方法无法完全修复胰岛，当然无法控制这 些疾病的进一步发展。而脂肪干细胞疗法不仅能促进受损的胰岛组织修复；而且能调节免疫 平衡，避免免疫损伤，是一种标本皆治的好方法，属于生物医疗技术的重大创新。

与现有的胚胎干细胞、iPS多能干细胞和骨髓干细胞相比较，脂肪干细胞不仅具有各类干 细胞具有的优势，还具有取材方便、创伤小、来源充足，一次可以获得大量新鲜的干细胞， 自体使用没有免疫排斥反应等优点，而且避开了胚胎干细胞的伦理学困扰和骨髓干细胞的来 源稀缺等麻烦。在临床和再生医学方面，脂肪干细胞取代其他各类干细胞服务于病人，成为 必然的趋势。

发明内容

脂肪干细胞分离：去除抽取的人体脂肪组织的下层血性肿胀液，将脂肪以500G离心3-5 分钟，去除离心后脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，按体积比1:1加入0.1％ 胶原酶溶液充分混匀后放入37℃摇床，并以200rpm消化30-40分钟，消化结束后再以800G 离心5-10分钟后获得干细胞沉淀，加入对应的患者血清10ml，充分混匀后加入以干细胞沉淀 和生理盐水的体积比1:5加入生理盐水，再以300G离心3-5分钟，离心后去除上层溶液，剩 余底部沉淀，以体积比1:7加入生理盐水，再以300G离心3-5分钟，重复3遍后，将最后得 到沉淀通过100μm滤器过滤，得到的滤液为脂肪干细胞溶液。

脂肪干细胞培养：将脂肪干细胞加入由10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成 的高糖DMEM培养基重悬，并用100目滤网过滤，将细胞悬液接种于培养瓶中，在37℃、 饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。48小时后换液，去除未贴壁细胞，此后每72小时换液1 次，至细胞融合至80％后弃去原培养液，PBS洗涤1次，加入适量0.25％胰蛋白酶+0.03％ EDTA进行消化3-5分钟，加入高糖DMEM培养基终止消化，以800r/min离心5分钟， 用含10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬沉积细胞， 按1:2的比例进行传代，当传代细胞生长接近单层融合70％时，可继续传代，传至第三代终 止。

将得到的脂肪干细胞以1.0×10⁶个/公斤体重通过静脉注射治疗II型糖尿病。

附图说明

图1成脂诱导分化检测图

图2成骨诱导分化检测图

图3成软骨诱导分化检测图

具体实施方式

(1)脂肪组织的采集：患者术前检查常规检查无异常后进行抽脂手术。对于手术部位的选择： 大腿内侧及髂腰最好，使用3mm抽脂管连接20ml注射器进行抽脂，抽脂量1000ml。

(2)脂肪干细胞的分离提取：

脂肪干细胞分离：去除下层血性肿胀液后，将脂肪以500G，3min离心，离心后脂肪分 三层，底层为血性液体，中层为纯脂肪，上层为油脂层，去除上层油脂和底层血性液体，获 取中层纯脂肪，按体积比1:1加入0.1％胶原酶充分混匀后放入37℃，200rpm摇床摇匀消化 30min，消化结束后放入800G，5min离心，离心后去除上层消化后的脂肪及溶液，剩余底部 5ml干细胞沉淀，取出37℃恒温箱内的患者血清，加入上述5ml干细胞沉淀用以中和胶原酶， 充分混匀后加入生理盐水至40ml，再以300G，3min离心，离心后去除上层溶液，剩余底部 5ml沉淀，再次加入生理盐水至40ml以300G，3分钟离心，重复3遍后，将最后得到5ml 沉淀通过100μm滤器过滤，得到脂肪干细胞溶液3.6ml。

(3)培养：