[发明专利]一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途。

(二)背景技术

血栓和栓塞性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。纳豆激酶(Nattokinase，NK)具有很强的纤溶活性，能直接作用于纤溶蛋白，也能激活体内纤溶酶原。与其他溶栓类药物相比，NK具有安全性好、成本低、纤溶活性强、可口服、作用时间长等优点，正作为一个开发预防和治疗血栓药物的研究热点，有望被开发为新一代的口服抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。

长期以来人们对肿瘤的治疗一般都是以手术、放疗、药物为主。其在杀死肿瘤细胞的同时也使得正常细胞受到伤害，往往会导致病情地加剧。用慢病毒治疗肿瘤是继传统治疗方式之后出现的一种全新治疗方法。

慢病毒载体是通过联合RNA干扰技术(RNAi)来治疗肿瘤：由于慢病毒载体能够以其侵染广泛宿主、稳定转染复制及静止期的细胞等独特优势，在基因治疗肿瘤的研究中得到了广泛的应用。研究表明慢病毒载体能够高效率传递肿瘤相关基因的短发夹RNA(shRNA)，并进行转录后沉默，可以使目的基因的表达受到抑制，减少肿瘤相关基因在肿瘤发展以及肿瘤侵袭中的促进作用，因而起到治疗作用。

(三)发明内容

本发明目的是构建输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，为进一步研究禽输卵管生物反应器和抗血栓药物研究提供基础。

本发明采用的技术方案是：

一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，由含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段插入慢病毒RNA干扰载体中获得，所述含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段序列如SEQIDNo.1所示。

所述慢病毒RNA干扰载体为慢病毒载体pGFP-OV2-ERE，由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1，所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQIDNo.2所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQIDNo.3所示。

本发明还涉及构建所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体的方法，所述方法包括：

(1)构建含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒；

(2)NK-2A-eGFP目的基因克隆：设计NK-2A-eGFP基因引物，以步骤(1)构建的质粒为模板，PCR扩增获得NK-2A-eGFP目的基因产物；

所述NK-2A-eGFP基因引物序列如下：

NK-2A-eGFP-F：5'-CGCCCCGGGTTGTTGCGCCGCGGCTT-3'

NK-2A-eGFP-R：5'-CGCCTCGAGAAAGGAGAGGGTAAAGA-3'；

(3)用XmaI和XhoI对NK-2A-eGFP目的基因产物和慢病毒载体pGFP-OV2-ERE进行分别进行双酶切，获得NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，连接NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，获得所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体pGFP-2A-NK-OV2-ERE。

所述慢病毒载体(鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体)pGFP-OV2-ERE按如下方法进行构建：

(A)鸡卵清蛋白启动子OV基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋白启动子OV引物，分别采用PCR扩增获得OV目的基因产物和ERE目的基因产物；

所述鸡卵清蛋白启动子OV引物序列如下：

OV-F：5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'

OV-R：5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3'；

所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：

ERE-F：5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'

ERE-R：5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAATCTTCT-3'；