[发明专利]一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途

权利要求书

1.一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，由含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段插入慢病毒RNA干扰载体中获得，所述含纳豆激酶基因的NK-2A-eGFP基因片段序列如SEQIDNo.1所示。

2.如权利要求1所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体，其特征在于所述慢病毒RNA干扰载体为慢病毒载体pGFP-OV2-ERE，由鸡卵清蛋白启动子基因OV和鸡雌激素反应元件ERE连接到慢病毒载体pLVshRNA-eGFP中替换质粒上的CMVpromoter元件获得，其质粒图谱见图1；所述鸡卵清蛋白启动子基因OV序列如SEQIDNo.2所示，所述鸡雌激素反应元件ERE序列如SEQIDNo.3所示。

3.构建如权利要求2所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体的方法，所述方法包括：

(1)构建含NK-2A-eGFP目的基因序列片段的pUC57质粒；

(2)NK-2A-eGFP目的基因克隆：设计NK-2A-eGFP基因引物，以步骤(1)构建的pUC57质粒为模板，PCR扩增获得NK-2A-eGFP目的基因产物；

所述NK-2A-eGFP基因引物序列如下：

NK-2A-eGFP-F：5'-CGCCCCGGGTTGTTGCGCCGCGGCTT-3'

NK-2A-eGFP-R：5'-CGCCTCGAGAAAGGAGAGGGTAAAGA-3'；

(3)用XmaI和XhoI对NK-2A-eGFP目的基因产物和慢病毒载体pGFP-OV2-ERE进行分别进行双酶切，获得NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，连接NK-2A-eGFP目的基因片段和线性化载体pGFP-OV2-ERE，获得所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体pGFP-2A-NK-OV2-ERE。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述慢病毒载体pGFP-OV2-ERE按如下方法进行构建：

(1)鸡卵清蛋白启动子OV基因克隆：提取鸡基因组DNA作为模板，设计鸡卵清蛋白启动子OV引物，分别采用PCR扩增获得OV目的基因产物和ERE目的基因产物；

所述鸡卵清蛋白启动子OV引物序列如下：

OV-F：5'-ACACTAGTGTCCTCAGACTTGGC-3'

OV-R：5'-GCACCGGTTGAACTCTGAGTTGTCTAG-3'；

所述鸡雌激素反应元件ERE引物序列如下：

ERE-F：5'-GTGAATTCCAGAAAAATGCCAGGTGG-3'

ERE-R：5'-GCACCGGTCGCACTAGTGAGAGTAAGCAACAATCTTCT-3'；

(2)含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE的构建：用EcoRI和AgeI分别双酶切ERE目的基因产物和慢病毒载体pLVshRNA-eGFP载体，获得ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-eGFP，连接ERE目的基因片段和线性化载体pLVshRNA-ERE-eGFP，获得含有雌激素反应元件的慢病毒表达载体pGFP-ERE；

(3)鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE的构建：用SpeI和AgeI双酶切OV目的基因产物和慢病毒表达载体pGFP-ERE，获得OV目的基因片段及线性化载体pGFP-ERE，连接OV目的基因片段和线性化载体pGFP-ERE，获得鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体pGFP-OV2-ERE。

5.如权利要求1或2所述的输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体在构建禽输卵管生物反应器中的应用。