[发明专利]定量检测糖基化蛋白的荧光速度传感方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物医学领域的技术，具体是一种定量检测糖基化蛋白的荧光速度传感方法。

背景技术

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，它与生物体的许多生命活动密切相关。糖基化蛋白代表着大多数细胞表面标记物和分泌性蛋白，人体内约有50％～60％的蛋白都是经过糖基化修饰的。糖基化蛋白(glycoprotein，GP)的研究有利于鉴定疾病的生物学标记和治疗靶位，发现潜在的治疗靶位，从而为疾病诊断提供帮助。

糖基化蛋白的分析方法有色谱法、亲和层析法、区带电泳法、毛细管电泳法、紫外分光光度法、电化学方法、高效液相色谱法、质谱法等。其中色谱法、亲和层析法、区带电泳法和毛细管电泳法可分离纯化糖蛋白；紫外分光光度法和电化学方法可对糖基化蛋白进行定性分析，但不能直接进行定量分析；高效液相色谱法和质谱法可对糖基化蛋白进行定量分析，但其操作复杂，需要专门的技术人员，且费用高。

为解决上述问题，Dong等人提出了移动超分子界面电泳技术(Moving Supramolecular Boundary Electrophoresis，MSBE)，利用一种荧光复合探针BBV-HPTS(boronic acid-based benzyl viologen(BBV)and hydroxypyrene trisulfonic acid trisodium salt(HPTS))，其中BBV是一种含有硼酸基的荧光猝灭剂，HPTS是一种含有两个磺酸基的荧光剂。在BBV的作用下，HPTS发生荧光猝灭，形成BBV-HPTS复合探针。但当BBV遇到糖/糖蛋白后，BBV上的硼酸基将会与糖/糖蛋白的二羟基共价结合形成五元环状复合物，同时释放出HPTS。在荧光显微镜下可以观察到，释放出的HPTS在电场下进行迁移，且其迁移速率(S)与糖/糖蛋白浓度(C)之间成线性关系。经检测证明，上述方法虽然可以快速测定糖/糖蛋白的浓度，但检测过程中误差值过大，检测稳定性及通用性不好。

发明内容

本发明针对现有电泳技术存在的上述不足，提出一种定量检测糖基化蛋白的荧光速度传感方法，通过硼酸探针(3-(dinaphthopyry-lium-4-yl)phenyl-boronic acid，以下简称Rp3)和2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸荧光素(2-(6-Hydroxy-3-oxo-(3H)-xanthen-9-yl)benzoic acid，以下简称F1)构建得到的新型荧光传感硼酸探针F1@Rp3对糖蛋白进行定量测定，能够用于快速有效、稳定性高、通用性好的测定糖基化蛋白浓度的基于荧光速度传感(fluorescent speed sensing，FSS)芯片超分子电泳(chipsupramolecular electrophoresis，CSE)测试。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明以糖基化蛋白标准品进行荧光速度传感-芯片超分子电泳(FSS-CSE)测试，获得不同浓度糖基化蛋白与荧光传感硼酸探针F1@Rp3结合后释放出的荧光素在电场下的对应不同迁移速率，构建出已知浓度糖基化蛋白与荧光素迁移速率之间的线性关系；然后采用相同的检测操作和检测条件利用FSS-CSE测试未知浓度糖基化蛋白，获得对应的荧光素在电场下的迁移速率，带入线性关系获得该糖基化蛋白的浓度。

所述的糖基蛋白包括但不限于：免疫球蛋白G、卵清蛋白及糖化血红蛋白。

所述的FSS-CSE测试，具体包括以下步骤：

i)将样品与聚丙烯酰胺凝胶一起灌注到毛细管中进行凝胶处理，然后在每根毛细管一端注入荧光传感硼酸探针后，将毛细管依次陈列到芯片超分子电泳装置中，且上样端置于电泳装置的阴极端。

所述的芯片超分子电泳装置参考文献：Dong,J.,Li,S.,Wang,H.,Meng,Q.,Fan,L.,Xie,H.,Cao,C.,Zhang,W.,2013.Anal.Chem.85,5884-5891.中所记载的电泳装置实现。

所述的荧光传感硼酸探针优选用量为1μL 20mM。

ii)将芯片超分子电泳装置置于荧光显微镜下，施加电场后，通过光学设备捕获释放出的F1，并生成一系列荧光成像图片，再通过图像处理得到F1在电场下的平均迁移速率。

所述的电场强度采用但不限于66.7V/cm。

所述的光学设备包括但不限于：CCD。

所述的一系列荧光成像图片，优选采用ToupView软件检测F1实时运动状态，每隔10s用ToupView软件捕获得到。