[发明专利]一种双相体系促进微生物合成2-羟基-3-苯基丙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种2-羟基-3-苯基丙酸的合成方法， 特别涉及一种双相体系促进微生物合成2-羟基-3-苯基丙酸的方法。

背景技术

2-羟基-3-苯基丙酸(PLA)，是一种广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中 的有机酸。大量研究表明PLA可以有效抑制包括食源性致病细菌、酵母和霉菌 等多种微生物的生长。在饲料添加剂、医药、化妆品等多方面都具有广泛的 应用前景。PLA对人和动物细胞均无毒性，还具有抑菌谱广，有望作为一种理 想的食品防腐剂而获得研究人员的广泛关注。

目前为止，主要应用真菌、乳酸菌、丙酸菌等微生物全细胞转化生产PLA。 但是转化过程中底物苯丙酮酸钠(PPA)在水中溶解度较低，而且对微生物的 生长有一定的抑制作用，生产得到的PLA的抑菌性也会对生产菌株具有抑制作 用，底物与产物的双重抑制作用限制了PLA产量的提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种水/有机双相体系及其合 成2-羟基-3-苯基丙酸PLA的方法。

为实现上述目的，本发明所要解决的第一方面的技术问题是提供双相体系 促进微生物合成2-羟基-3-苯基丙酸的方法，包括如下步骤：

(1)选择有机溶剂，配制水/有机溶剂双相体系；

(2)活化菌体细胞，收集菌体用缓冲液洗涤后，悬浮在上述的水/有机溶 剂双相体系，并加入底物苯丙酮酸钠和葡萄糖，进行全细胞转化过程的优化；

(3)在发酵罐中通过间歇补加底物于水/有机溶剂双相体系进行全细胞转 化PLA。

本发明的一优选技术方案中，所述的菌体细胞选自大肠杆菌细胞、芽孢杆 菌、乳酸菌。

本发明的一优选技术方案中，步骤(1)中，所述有机溶剂选自甲苯、乙酸 乙酯、醇类、不饱和脂肪酸、液态烷烃或其取代衍生物。

本发明的一优选技术方案中，步骤(1)中，所述有机溶剂选自环己烷、己 烷、辛烷、三氯甲烷、油酸、异戊醇。

本发明的一优选技术方案中，步骤(1)中，所述有机溶剂正辛烷。

本发明的一优选技术方案中，步骤(1)中，所述水/有机溶剂双相体系中， 水相与有机相的体积比为1.5-1:1。

本发明的一优选技术方案中，步骤(2)中，水/有机溶剂双相体系中含有 磷酸盐缓冲液；且优选pH为7.0。

本发明的一优选技术方案中，步骤(2)中，所述转化过程的温度为30-45℃。

本发明的一优选技术方案中，步骤(2)中，所述转化过程中采用200rpm-350 rpm转速进行转化。

本发明的一优选技术方案中，在优选转化条件下，分批补加大肠杆菌菌体、 底物苯丙酮酸钠和葡萄糖生产PLA。

本发明的一优选技术方案中，所述的大肠杆菌细胞优选为E.coliBL21-pET-28a- D-LDH^Y52V；制备得到(R)-2-羟基-3-苯基丙酸。

本发明的方法中，转化体系中，菌体浓度为10g/L-40g/L，优选为20g/L； 底物苯丙酮酸钠浓度为10g/L-25g/L，优选为15g/L。

本发明具有的优点和有益效果是：配制形成水/有机双相体系，底物的溶解 度增加，生成的产物部分溶解于有机相中，减轻了底物和产物对生产菌株的抑 制作用，从而提高产物的产量。

双相体系是形成水相与有机相的混合两相，在此体系下转化底物PPA生成 PLA，PPA与PLA在水相与有机相中的分配系数不同，选择PLA溶解度高，PPA 溶解度低的有机溶剂，增加PPA的溶解度，同时使生产得到的PLA部分溶解于 有机相中，减少由于PLA的抑菌作用造成的对生产菌株的抑制，从而提高PLA 的产量，发酵罐恒速流加底物生产PLA，测得PLA产量为22.57±0.02g/L。在 5L发酵罐中PLA产量达到22.57g/L。

附图说明

图1为水相与正辛烷体积比对PLA产量的影响。

图2为转化温度对PLA产量的影响线形图。

图3为转速对PLA产量的影响柱形图。

图4为底物浓度对PLA产量的影响柱形图。

图5为菌体浓度对PLA产量的影响柱形图。

图6为最优条件分批补加底物生产PLA的曲线图。