[发明专利]一种快速将水稻转化为香稻的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及通过基因工程技术培育香稻植株的方 法。

背景技术

水稻是世界最重要的粮食作物之一，世界多数人口都以水稻作为主食。随着人们 生活水平的提高以及健康意识的不断增强，营养丰富、品质优良的功能型稻米越来越受到 人们的青睐。

香稻以其气味芳香而得名,香稻的香味可存在于水稻植株除根部外的茎、叶、花、 稻米中。香米不仅在蒸煮后溢出芳香扑鼻的香气,而且营养品质优良,富含各种氨基酸和蛋 白质,在国际市场上优质香米的售价是普通稻米的2～3倍,在国际稻米贸易中占有重要的 地位

研究表明，香稻含有多种挥发性化合物，而直接与水稻香味相关的挥发性物质为 2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)。由于甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2功能的缺 失会导致2AP前体物质的增加，从而积累2AP使稻米产生香味。自Bradbury等首先发现水稻 第8染色体Badh2基因第7外显子8bp缺失及3bp突变产生无功能蛋白导致水稻香味以来，该 基因序列已经有13处位点的变异被相继报道。因此只要对甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2缺失 或突变就可以提高水稻的香味。

CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats) 是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR/Cas是细 菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中， crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成 双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链 DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(sgRNA)表达同样可以起 到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的优点是操作简单，对基因组的效率高。需要对某一个靶 位点编辑的时候，只需要表达相应的sgRNA即可，不需要对Cas9核酸酶进行改造。它可对任 何物种的基因组进行高效率的定向编辑。

常规选育香稻是通过与香稻杂交或回交选育，周期长还将不利基因带入，利用 CRISPR/Cas9技术，选择Badh2基因的目标靶位点，构建gRNA靶点质粒，并导入到目标水稻的 基因组中对目标靶点剪辑，将Badh2基因沉默，积累2AP使稻米产生香味。再通过自交或杂交 将遗传转化的元件与剪辑后的基因分离得到纯合的可以稳定遗传的香稻。

发明内容

利用CRISPR/Cas技术，根据水稻香味代谢过程中相关基因序列，筛选出该基因靶 点位置，以靶点基因序列为基础构建gRNA靶点质粒，并导入到目标水稻的基因组中对目标 靶点剪辑将其沉默，使香味相关物质不能代谢或分解，造成香味物质大量积累，使稻米产生 香味，再通过自交或杂交将遗传转化的元件与剪辑的基因分离，在不影响水稻的其它基因 结构和性状，快速得到纯合的可以稳定遗传的香稻。其中，本发明所述基因的概念是指包括 基因的5’端非编码区、外显子、内含子和3’端非编码区。

首先，香味代谢相关基因可以选择对香味有重要作用的基因，只要其表达下调或 缺失即能导致香味物质的积累，增加稻谷的香味。本发明中，优选甜菜碱醛脱氢酶基因 Badh2，其功能的缺失会导致与水稻香味相关的挥发性物质为2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl- 1-pyrroline,2AP)前体物质的增加，从而积累2AP使稻米产生香味。

因此利用CRISPR/Cas技术，选择与代谢香味相关的基因Badh2，在其序列中找到可 以剪辑的NGG目标靶点，根据目标靶点周边的基因序列，设计基因打靶gRNA组装序列，构建 gRNA靶点质粒，通过农杆菌转化法将目标基因转到水稻基因组中。对基因Badh2目标靶点进 行精确的剪辑，将基因Badh2沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其它的基因和功 能。再通过自交或杂交将遗传转化到水稻基因组中的基因片段与被剪辑的基因分离，在不 影响水稻的其它的基因和功能，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。

下面对本发明的具体内容进行描述。

本发明提供一种与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA 的21-23bp的gRNA核苷酸序列。