[发明专利]一种快速将水稻转化为香稻的方法

权利要求书

1.与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核 苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的与水稻香味代谢过程中相关基因序列中NGG特异性结合的 crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13任一所示。

3.根据敲出Badh2基因的靶点设计gRNA靶点的相关基因的序列转化到水稻中相关质 粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14至18任一所示。

4.T7-gRNA-FPg引物，其序列如：

TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中， NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。

5.一种带有Badh2基因敲出后的基因序列的香稻的制备方法，其特征在于：

利用CRISPR/Cas技术，选择与代谢香味相关的基因Badh2，在其序列中找到可以剪辑的 NGG目标靶点，根据目标靶点周边的基因序列，设计基因打靶gRNA组装序列，构建gRNA靶点 质粒，通过农杆菌转化法或其它转化法将目标基因转到水稻基因组中；对基因Badh2目标靶 点进行精确的剪辑，将基因Badh2沉默，从而积累2AP使稻米产生香味，而不影响其它的基 因和功能；再通过自交或杂交将遗传转化到水稻基因组中的基因片段与被剪辑的基因分 离，快速得到纯合可以稳定遗传的香稻。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）在Badh2基因中找到具有NGG特异性结合crRNA的21-23bp的核苷酸序列，即gRNA靶 点位置；

（2）根据步骤（1）中的特异性的核苷酸序列进行gRNA靶位设计，再利用体外酶切活性检 测SSTgRNA靶点效率；

（3）根据步骤（2）中体外切割活性检测结果，选择酶切效率高的靶点，构建gRNA质粒；

（4）将构建的gRNA质粒通过农杆菌转化法或其它转化法转到水稻的基因组中；

（5）Cas9核酸酶在gRNA的引导下定向切割该基因序列,造成DNA的双链断裂，利用DSB 的修复机制,实现基因的定点敲除；

（6）Badh2基因被定点敲出后的植株通过自交或受体亲本杂交将转基因的片段与敲出 的基因分离得到遗传稳定的香稻。

7.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于：与水稻香味代谢过程中相关基 因序列中NGG特异性结合的crRNA的21-23bp的gRNA核苷酸序列，其序列如SEQIDNO：2至13 任一所示。

8.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于：根据敲出Badh2基因的靶点设计 gRNA靶点的相关基因的序列转化到水稻中相关质粒的基因序列，其序列如SEQ果IDNO：14 至18任一所示。

9.根据权利要求5或6所述的的制备方法，其特征在于：T7-gRNA-FPg引物，其序列如：

TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC所示，其中， NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是SEQIDNO：2至13任一所示的序列。

10.一种对香味代谢过程中相关基因序列剪辑后的基因，其特征在于：在NGG特异附近 基因缺失几个碱基，使此基因沉默。