[发明专利]一种基因重组人C肽融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

一种基因重组人C肽融合蛋白及其制备方法与应用：该融合蛋白是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒S片段从167至224氨基酸片段的58个氨基酸即LCMVs(167‑224)与人C肽的全序列31个氨基酸串联形成的融合蛋白；LCMVs(167‑224)在融合蛋白的N端，人C肽的全序列在融合蛋白的C端；LCMVs(167‑224)氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，人C肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该融合蛋白比偶联BSA或KLH刺激小鼠的免疫反应能力更强，免疫小鼠获得的抗血清对于C肽效价更高，更容易制备出高亲和力的C肽抗体用于免疫学检测，在抗体制备和免疫学检测等领域将有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种基因重组人C肽融合蛋白(C肽融合蛋白)，具体为一种基因重组人C肽融合蛋白即LCMVs(167-224)-C肽及其制备方法与应用，属于基因工程技术、抗体制备、免疫检测等领域。

背景技术

C肽(人C肽)是指胰岛素原(由86个氨基酸组成，分子量9000道尔顿，它的结构是由胰岛素及连接肽两部分组成，连接肽有35个氨基酸组成)随细胞浆中的微泡进入高尔基体，它在胰岛素原转化酶作用于分解时，与胰岛素的AB两链相接的CA1赖氨酸、CA2精氨酸、Bc1精氨酸及Bc2精氨酸等四个氨基酸分离形成的31个氨基酸的多肽。

正常人24h尿中排出C肽为36±4μg。幼年型糖尿病者为1.1±0.5μg；成年型糖尿病者为24±7μg。C肽清除率与肌酐清除率无明显关系。C肽的清除滤较胰岛素微高。C肽为5.1±0.6mL/min，后者为1.1±0.2mL/min。每日C肽排出量相当于胰岛分泌量的5％，占胰岛素总量的0.1％，因此C肽的测定可应用于临床。C肽具有如下特点：(1)在胰岛的β细胞的分泌中，胰岛素与C肽总分子量相等。(2)胰岛素半衰期为4.8min，而C肽为11min，胰岛素原为17.5min。(3)胰岛素在肝肾内分解而C肽不被分解是完整链从肾脏排出。(4)C肽无生物学活性，但具有很强的种属特异性，与抗胰岛素无交叉免疫反应。由于胰岛素原的浓度还不到C肽的十分之一，故一般检测C肽(总C肽)可代表血中的游离C肽。

C肽测定具有重要的临床意义：(1)可反映机体胰岛β细胞的分泌功能；(2)C肽测定对糖尿病患者的分型和低血糖症的鉴别有指导意义；(3)测定C肽浓度可作为鉴定胰脏手术后的疗效和残存β细胞分泌功能的一项定量指标，以确定是否给与胰岛素。在随访中多次测定C肽浓度，也有利于判定肿瘤有无复发或转移。

直接免疫C肽无法获得抗C肽特异性抗体，加入一般的载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)同样很难免疫得到高亲和力的特异性抗体。对于一些特殊的半抗原，选择合适的载体蛋白成为了制备其优良抗体的关键。

LCMV(淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒)能感染人和许多种动物，使其患淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(Lymphocytic Choriomeningitis，LCM)。LCM为人畜共患病，小鼠、豚鼠、仓鼠、犬、猴、鸡、兔和棉鼠均易感。LCMV病毒是非溶细胞性病毒，在动物体内增殖并不对机体产生损害，而是动物本身对病毒的免疫反应，导致对机体的损害而表现出临床症状。急性感染的小鼠由于不同的组织和病毒数量而产生不同程度的免疫反应，反应强烈的可引起动物死亡。该病毒能在体内引起强烈反应的主要片段是LCMVs。

通过选择优势抗原片段中的抗原表位区域所编码的基因序列，截取LCMVs中优势抗原区域作为C肽的载体，通过基因工程和层析技术，获得优良的完全抗原。C肽作为半抗原，只有抗原性，没有免疫原性，很难引起动物的免疫反应，与LCMVs优势抗原区域偶联后，获得的完全抗原能够免疫动物产生高效价的抗体，是制备C肽抗体的必要条件。

发明内容